水稻细菌性条斑病菌VI型分泌系统的功能鉴定

The bacterial type VI secretion system (hereafter T6SS) is a recently discovered macromolecular secretion system which plays an important role in the pathogenicity and environmental adaptation of a variety of phytopathogenic bacteria. Our research group has annotated the homologous genes for encoding T6SS from the recently sequenced genome of the rice bacterial leaf streak disease pathogen Xanthomonas oryzae pathovar oryzicola (hereafter Xoc) GX01 strain. The pilot experimental results showed that the mutation in the annotated translocation protein encoding gene hcp1 resulted in significantly reduction in virulence of Xoc, suggesting that the T6SS may be involved in the pathogenesis of this pathogen. The overall aims of this proposal are to elucidate the relation between T6SS and the pathogenicity of Xoc, and to identify the T6SS effectors and their genes. The major research contents include: 1. elucidation of the role of T6SS in the pathogenesis of Xoc by mutant phenotypic analysis and plant assays; 2. Selection of the induction medium for T6SS operons by using the gus reporter; 3. Identification of the T6SS effectors and their genes by comparative proteome profiling of the Xoc wild type and the T6SS key gene mutant. The results in this project will facilitate the researches for identification of the host targets of the T6SS effectors and elucidation the functional mechanism of T6SS in the pathogenesis of Xoc.

细菌的VI型分泌系统（T6SS）是一种新发现的大分子分泌系统，在多种病原细菌的致病性及环境适应性中发挥重要作用。本课题组从最近测序的水稻细菌性条斑病菌（Xoc）GX01菌株全基因组中注释了编码T6SS系统的同源基因。先导实验结果显示，注释的编码转位蛋白的基因hcp1突变导致该菌的致病力显著降低，提示T6SS可能与Xoc的致病功能相关。本研究的目的是阐明T6SS与Xoc致病性之间的关系，并鉴定依赖T6SS的效应子及基因。研究内容包括：1.构建T6SS的关键基因的缺失突变体，通过表型和致病力检测，明确T6SS在Xoc致病中的作用；2.构建T6SS操纵子表达gus报告子，筛选T6SS基因诱导表达培养基；3.进行野生型菌株与T6SS关键基因突变体间的分泌蛋白组比较，鉴定Xoc的T6SS效应子及基因。研究结果将为下一步鉴定T6SS效应子的寄主靶标、阐明T6SS在Xoc致病机制中的作用机理打下基础。

细菌的VI型分泌系统（T6SS）是一种新发现的大分子分泌系统，在多种病原细菌的致病性、菌间竞争和环境适应中发挥重要作用。在Xoc GX01的基因组中注释了两套编码T6SS的同源基因簇，分别命名为T6SS1和T6SS2，为了弄清T6SS系统在Xoc中作用，我们采用反向遗传学、分子生物学方法和微生物学常规实验技术，构建了两个基因簇的单缺失突变体和双缺失突变体,构建了关键基因clpB-like、clpB2、hcp1、hcp2、icmF和lip等单个基因突变体，以及hcp1与hcp2双缺失突变体，并进行了生理生化表型鉴定、致病力检测、菌间竞争性测试等研究。结果表明：（1）突变体DMT6SS1、DMT6SS2 和DMT6SS1/DMT6SS2的胞外多糖产量、胞外蛋白酶分泌、生物膜形成和游动能力均没有发生变化，但三个突变体的致病力比野生型菌株分别下降了17.7%，15.6%和25.0%。（2）突变体ΔclpB-like和ΔclpB2的胞外多糖产量、胞外蛋白酶分泌和生物膜形成能力没有变化，ΔclpB-like突变体的游动性显著减弱。ΔclpB-like和ΔclpB2的致病力分别降低了26.7%与21.0%。（3）突变体Δlip和ΔicmF在生长速率、胞外多糖、胞外蛋白酶、游动性、生物膜形成以及致病力与GX01相比均无显著性差异。（4）与GX01相比，突变体DMT6SS1、DMT6SS2、Δhcp1的Δhcp2对大肠杆菌DH5α菌株的抑制程度显著下降。（5）过量表达hcp2基因的Xoc 菌株，生长速率、胞外多糖产量、游动能力极显著增强，致病力极显著降低。而过量表达hcp1，则没有上述效果。（6）发现在Xoc GX01菌株中含有一个内源质粒pXOCgx01，带有一套编码IV型分泌系统（T4SS）的基因簇，其中部分基因的产物可与T6SS系统互用。pXOCgx01可显著提高受体菌对重金属的耐受性。.本课题系统地研究了水稻细菌性条斑病菌T6SS的功能，明确了T6SS对Xoc的基本生长、基本生理生化表型没有影响，对病菌的毒力有一定影响，但不是该菌主要的致病因子。hcp2基因过表达显著提升了Xoc菌体生长速率，但减弱了致病力。pXOCgx01质粒是在Xoc菌株中首次发现和鉴定的内源性质粒，该质粒在病菌进化中起一定作用。这些研究结果为全面揭示T6SS功能提供新的内容。