异化金属还原菌高效捕捉重金属系统的构建及作用机制研究

Dissimilatory metal-reducing bacteria (DMRB) have broad application prospects in the treatment of heavy metal wastewater because of their unique extracellular electron transfer capabilities. At present, the mechanism and regulation of extracellular electron transfer during the process of heavy metal reduction and adsorption have not been clarified yet, and the treatment efficiency is relatively low, which becomes a bottleneck restricting the treatment of heavy metal wastewater by DMRB. In this project, Shewanella oneidensis MR-1, a model strain of DMRB, was studied to solve the problem. We started by exploring the mechanism of reduction and adsorption of heavy metal by DMRB. The key extracellular electron transfer pathways and manners in the process were explored, and its regulatory mechanism was exploited. Then, we utilize gene expression tuning tools to optimize the extracellular electron transfer pathway, thus strengthening its reduction and adsorption capacities. By coupling with the cell surface display of metallothionein in a three-dimensional manner, we aim to further promote the heavy metal adsorption capacity, thus a whole-cell heavy metal capturing system is constructed. Finally, through the rational design and construction of cell aggregation program, the cells are controlled to aggregate, facilitating the cell separation from the water for heavy metal recovery. This project will provide the theoretical basis for the practical application of DMRB in the heavy metal wastewater treatment.

异化金属还原菌因为其独特的胞外电子传递能力而在重金属废水处理中具有广阔的应用前景。目前，胞外电子传递在重金属还原和吸附过程中的机制和调控尚未阐释清晰，重金属离子处理效率较低，成为制约异化金属还原菌处理重金属废水的“瓶颈”因素。本项目以异化金属还原菌模式菌株 Shewanella oneidensis MR-1 为研究对象，在深入解析其还原和吸附重金属离子的途径和机制基础上，探索重金属离子还原和吸附的关键胞外电子传递途径和方式，并阐明其调控机制；基于此，利用基因表达调控工具实现对胞外电子传递途径和方式的系统调控和优化，强化其还原和吸附能力，并耦合金属硫蛋白细胞表面立体展示，进一步促进重金属离子的处理能力，从而构建一个全细胞的重金属离子捕捉系统；最终通过理性设计和构建细胞聚集程序，控制细胞的自动聚集，以便于从水体中快速分离回收。本项目将为异化金属还原菌处理重金属离子废水的实际应用提供理论依据。

异化金属还原菌（Dissimilatory metal-reducing bacteria，DMRB）具有独特的胞外电子传递能力，从而在重金属废水处理等环境应用中具有广阔的前景。目前，DMRB还原和转化重金属等污染物的机制和调控尚未阐释清晰，并且处理效率较低，成为制约其应用的“瓶颈”。本项目以解析DMRB污染物转化机制并进行合成生物学强化为目标。首先，建立了DMRB基于CRISPR-ddAsCpf1的高通量筛选平台，以鉴定污染物转化的关键胞外电子传递途径。开发的 CRISPR-ddAsCpf1 系统可以高通量的实现基因抑制筛选。分别使用 WO3 探针、甲基橙和典型重金属六价铬(Cr6 )为末端电子受体，鉴定出了有效增强胞外电子传递的靶点，并阐明了不同传递途径之间的电子竞争机制，为针对特定污染物设计高效胞外电子传递路径提供了理论基础。其次，DMRB基因编辑工具的缺乏是制约其机制解析和工程改造的一个关键因素。通过理性设计，建立了基于归巢核酸内切酶I-SceI耦合 Red 或 RecET 重组系统的新型微生物基因编辑工具iEditing，实现了高效基因编辑，编辑效率可达近100%。iEditing工具操作简便、无脱靶效应，且因结构简单而具有微生物广谱适用性。另外，通过建立DMRB一体型 CRISPR 基因编辑技术，在全基因组尺度上系统改造和优化了胞外电子传递基因网络，实现了菌株胞外电子传递能力和放射性核素铀还原能力的大幅提升。通过该部分研究的实施，创制了微生物基因编辑工具并全局重塑胞外电子传递基因网络。接下来，建立了基于细菌群体感应系统的自感应细胞群体状态的智能决策系统动态调控胞外电子传递，智能的实现细菌根据群体状态动态地分配细胞资源以强化胞外电子传递水平，该系统优化了细胞资源在不同细菌群体状态下的分配，实现了胞外电子传递水平和污染物转化效率的大幅提高。智能动态调控策略较其他合成生物学策略具有显著的优势，自适应调控模式较一般静态控制模式具有更佳的增强效果。通过本项目的实施，有效地为DMRB的环境应用提供了理论依据，也为接下来更深入的研究奠定了坚实基础。