脯氨酰羟化酶-2在慢性哮喘气道重构中作用机制的研究

气道炎症和重构是支气管哮喘的两个主要病理学特征。目前哮喘治疗主要是控制气道炎症，但药物对部分患者无效，主要原因是气道重构导致药物有效性下降。在哮喘气道重构中，气道平滑肌（ASM）调节气道结构的主要效应细胞之一，抑制ASM细胞增殖或促进其凋亡可能抑制气道重构。脯氨酸羟化酶（PHDs)是调节缺氧诱导因子的关键酶，包括PHD1、2和3三种亚型，其在调节HIF-1α诱导的参与细胞代谢、增殖、存活等基因表达中起重要作用。PHD2是常氧条件下的主要氧感受器，研究提示抑制PHD2表达能够限制血管平滑肌的增殖和血管重构。目前PHD2在哮喘ASM细胞和气道重构中的作用尚未研究，本研究拟通过干预哮喘的ASM中PHD2的表达，抑制ASM细胞增殖或促进其凋亡，以抑制或削弱哮喘气道重构，为哮喘防治提供依据。

本项目拟通过干预哮喘的ASM中的PHD-2的表达，抑制ASM细胞的增殖或促进其凋亡，以抑制或削弱哮喘的气道重构，从而为哮喘防治提供依据。本研究成功建立哮喘小鼠模型（连续雾化4周、8周、12周和18天）。分离ASM后，Q-PCR检测PHD-2和HIF-1α的mRNA表达。与对照组比较，连续雾化18天、4周和8周的哮喘组的PHD-2和HIF-1α的mRNA的表达均显著降低。而连续雾化12周的哮喘组ASM中PHD-2和HIF-1α的mRNA的表达均显著增加，但均未在ASM中检测到蛋白的表达。通过免疫组化检测哮喘和正常对照小鼠的PHD-2蛋白的表达。与正常对照组比较，哮喘小鼠气道上皮细胞的PHD-2蛋白表达显著减低，哮喘小鼠的炎性细胞，尤其嗜酸性细胞（EOS）中PHD-2的表达显著增多。在正常对照和哮喘小鼠中的ASM和肺血管平滑肌中均未检测到PHD-2蛋白的表达。体外培养小鼠原代气道上皮细胞（MTEC），在气液相开始时即加入不同浓度的IL-13（1ng/ml和10ng/ml）分别干预1天、2天和14天后检测MTEC中PHD2、HIF-1α和Muc5AC的mRNA水平。结果显示：与对照组比较，IL-13干预14天组小鼠MTEC的PHD-2、HIF-1α表达下降，而Muc5AC的表达则增加，而该体外的检测结果与连续雾化18天、4周和8周的哮喘小鼠体内实验的趋势也是一致的。为了进一步深入地探讨PHD2在哮喘气道上皮细胞MUC5AC表达中的作用，我们也利用人的气道上皮细胞株Beas2B细胞进行人的PHD2质粒的过表达并体外干预人的IL-13 (50ng/ml)后检测Muc5AC的改变。结果发现：与对照组比较，人PHD2质粒过表达组在IL-13干预后气道上皮细胞的Muc5AC mRNA表达下降。这些结果进一步提示PHD2在哮喘气道上皮的粘液分泌中起着重要的调控作用，可能可以通过抑制Muc5AC的表达从而减少粘液的分泌。与正常对照组，哮喘小鼠的炎性细胞，尤其EOS中PHD-2的表达显著增多。那么我们假设在骨髓EOS分化过程中PHD-2是否也参与了调控作用，目前初步实验发现在骨髓EOS分化的不同时间点，PHD-2的表达是变化的，在后续试验中我们将会利用体外培养骨髓EOS细胞，通过转染慢病毒构建PHD-2过表达来进一步探讨其在骨髓EOS细胞分化、成熟等过程中的作用。