赖氨酰羟化酶PLOD2在肝癌转移中的作用及机制研究

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the second leading cause of cancer-related death worldwide, most of which died of metastasis. Dissecting the role and mechanism of metastasis-related molecules in HCC will contribute to suppress tumor metastases. We recently conducted a proteomic analysis of HCC tumor tissues, and fund that disease-free survival rate in the high-expression group for the lysyl hydroxylase PLOD2 gene was significantly shorter than that of the low-expression group. Our previous data suggest that PLOD2 may be a potential drug target for inhibiting HCC metastasis. However, the role and mechanism of PLOD2 in HCC metastasis remains unclear. In this project, we will investigate the role of PLOD2 in HCC metastasis at cell and animal levels, followed by using Minoxidil, the inhibitor of PLOD2, to verify the function of PLOD2 in vivo. Finally, RNA-seq and mass spectrometric analysis will be utilized to investigate the molecular mechanisms of PLOD2 regulating HCC metastasis in cells. Our project will clarify the potential of PLOD2 as a drug target in the treatment of HCC and the possible mechanism of PLOD2 promoting HCC metastasis.

原发性肝癌（简称肝癌）是全球死亡率第二的恶性肿瘤，转移复发是导致肝癌患者死亡的主要原因。研究肝癌转移的分子机制将为肝癌的治疗提供理论基础。我们通过对肝癌组织样本的蛋白质组数据进行分析，发现赖氨酰羟基化酶PLOD2蛋白表达量与肝癌患者术后不良预后正相关，并且前期数据提示该蛋白有可能成为抑制肝癌转移的药物靶点。PLOD2在肝癌转移中的作用和机制尚不清楚。本研究拟在细胞水平和小鼠体内分析PLOD2对肝癌转移能力的影响；并在体内进一步验证PLOD2药物Minoxidil抑制肝癌转移的效果；最后，利用RNA-seq和质谱等技术，分别在转录组和蛋白质组水平研究PLOD2在肝癌细胞内调控转移的分子机制。预期通过本研究明确PLOD2在肝癌治疗中作为药靶的潜力，并解析PLOD2促进肝癌转移的可能机制。

我们基于蛋白质组学的研究发现赖氨酰羟基化酶PLOD2蛋白在肝癌肿瘤组织中高表达，且与肝癌患者的不良预后显著正相关。本项目在细胞水平研究了PLOD2对肝癌细胞转移能力的影响，分析了PLOD2的可靶向性，并对PLOD2促进肝癌细胞转移的分子机制进行了探究。首先检测PLOD2在8种不同肝癌细胞系中的表达水平，选择表达PLOD2较高、转移能力较强、生长状态良好的MHCC97H细胞和Huh7细胞构建敲低细胞株，选择PLOD2表达较低的PLC/PRF/5细胞构建过表达细胞株，通过CCK8、划痕实验和Transwell等生物学功能实验，发现敲低PLOD2显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而过表达PLOD2则促进肝癌细胞转移相关生物学行为。利用PLOD2抑制药物Minoxidil处理细胞后，发现Minoxidil抑制PLOD2表达且具有剂量依赖性，同时经Minoxidil处理后，肝癌细胞增殖、迁移和转移能力均下降，以上结果提示PLOD2在肝癌转移中有一定的可靶向性。对PLOD2敲除细胞株进行转录组分析，共筛选出351个差异基因，其中上调基因148个，下调基因203个，PLOD2敲低后，发现黏着斑、ECM-受体相互作用、PI3K-AKT等信号通路等信号通路显著下调，提示PLOD2可能通过上述通路影响了肝癌细胞的转移。利用MHCC97H细胞进行内源性免疫沉淀实验，质谱鉴定与PLOD2相互作用的蛋白，通过免疫共沉淀验证发现PLOD2与caveolin-2（CAV2）蛋白相互作用，而不与同家族的CAV1蛋白相互作用。有研究表明CAV2在胶质瘤组织中高表达，对胶质瘤的上皮细胞-间充质转化（EMT）过程具有明显的促进作用，同时另一项研究发现在CAV2过表达的细胞中，PLOD2表达上调，而在CAV2低表达的细胞中，PLOD2表达下调，以上结果均提示PLOD2可能通过与CAV2相互作用促进肝癌细胞转移。对PLOD2脯氨酰羟化酶活性位点突变后，PLOD2丧失对肝癌细胞的促进作用，因此PLOD2在肝癌转移中的作用可能还依赖于其脯氨酰羟化酶活性。本研究结果为探索肝癌转移的新机制、评价PLOD2是否可作为肝癌治疗的潜在靶标提供了分子依据。