重组ADAMTS13对出血性脑损伤的保护作用及其机制

Intracerebral hemorrhage (ICH) is a common subtype of stroke and is associated with high mortality and morbidity rates. However, currently there are still no specific therapies available for ICH. Recently, we have demonstrated that recombinant ADAMTS13 (rADAMTS13) reduced tPA-induced blood-brain barrier dysfunction and hemorrhage after ischemic stroke. However, the role of rADAMTS13 on ICH remains to be elucidated. Our preliminary data show that rADAMTS13 significantly reduced inflammation, blood-brain barrier disruption, edema formation and brain injury in a mouse model of ICH. In this project, we will further investigate the mechanism of rADAMTS13 in limiting brain injury following ICH in both in vitro and in vivo experiments. We will employ ICH model of ADAMTS13 knockout mice, rADAMTS13, cerebral endothelial cell cultures, multi-photon confocal microscopy, neutrophils depletion, behavioral analysis, and molecular biological approaches to determine whether the reduced inflammation by treatment with rADAMTS13 is responsible for further blood-brain barrier changes, and whether these effects contribute to the improvement of brain edema formation and secondary brain damage after ICH. We will also determine the mechanisms by which rADAMTS13 regulates inflammation and blood-brain barrier permeability alterations after ICH. These proposed studies will not only provide novel insights into the cellular and molecular responses to ICH, but should also help the development of new therapeutic strategies for limiting brain damage after ICH.

脑出血的防治一直是医学界的难题。我们前期研究证明，ADAMTS13能降低脑缺血后溶栓引起的血脑屏障损伤和出血转化。然而，对其在出血性脑损伤中的作用，国内外均未见报道。我们在最近的预实验中发现，ADAMTS13不仅能降低脑出血后的炎症反应和血脑屏障破坏，并且可减轻脑水肿和脑实质损伤。在此基础上，本项目拟采用小鼠脑出血模型，结合体外脑血管内皮细胞炎症反应模型，借助ADAMTS13基因敲除、重组ADAMTS13、中性粒细胞选择性清除、多光子显微镜活体脑血管成像、神经行为测定以及分子生物学等多种方法和手段，系统研究ADAMTS13减轻脑出血后炎症反应和降低血脑屏障损伤的分子机制，阐明ADAMTS13是否通过其抗炎作用，阻止血脑屏障主要组分的降解和血脑屏障破坏，最终减轻脑水肿和脑实质损伤，并揭示其作用的关键靶点和信号通路。这些研究将为开发有效的脑出血防治药物提供新的思路和理论依据。

脑出血是最具破坏力的卒中类型之一，约占全部卒中的10-20%，目前尚无有效的治疗方法。脑出血能激活免疫细胞，促进炎症调节介质的释放。炎症细胞侵入脑实质，会加重血脑屏障损伤，进而引起继发性脑水肿和脑实质损伤。研究发现金属蛋白酶ADAMTS13能通过蛋白水解VWF减轻炎症反应。有报道指出敲除ADAMTS13基因增加脑缺血后炎症反应和脑损伤的程度，而给予重组ADAMTS13则减少中性粒细胞渗出，减轻脑损伤。我们前期研究证明重组ADAMTS13能降低脑缺血后溶栓引起的血脑屏障破坏和出血并发症。因此，本项目进一步研究了重组ADAMTS13对出血性脑损伤的作用和机制。结果发现重组ADAMTS13减少脑出血后趋化因子CXCL1、CXCL13、CCR1和促炎症因子IL-6、IL-1β水平以及髓过氧化物酶活性，减轻小胶质细胞激活和中性粒细胞脑组织浸润。采用培养的脑微血管内皮细胞，发现给予提纯的人血浆VWF增加LPS诱导的白介素IL-6表达上调，而重组ADAMTS13能够降低LPS诱导的IL-6上调。并且，VWF可完全逆转重组ADAMTS13的作用。给予VWF增加脑出血后ICAM-1表达及MMP-9活性，而重组ADAMTS13则降低ICAM-1表达及MMP-9活性。采用培养的脑微血管内皮细胞，发现重组ADAMTS13抑制LPS诱导的ICAM-1表达上调，然而VWF能够逆转重组ADAMTS13的作用。给予VWF增加脑出血后血脑屏障通透性、脑水肿和炎症反应，而敲除小鼠VWF基因或给予VWF抑制抗体均可减轻脑出血后血脑屏障破坏和脑水肿，并改善神经功能。进一步研究发现，重组ADAMTS13减少脑出血后脑微血管周细胞损失、降低血脑屏障通透性、减轻脑水肿、神经细胞变性死亡和脑实质损伤，并改善小鼠受损的神经功能。中性粒细胞选择性清除可减轻脑出血后血脑屏障破坏，然而在清除中性粒细胞状态下，重组ADAMTS13不能进一步降低脑出血引起的血脑屏障破坏，表明重组ADAMTS13对血脑屏障的保护作用至少部分通过中性粒细胞介导的炎症反应。以上结果表明重组ADAMTS13可能通过调控脑出血后VWF-ICAM-1-MMP-9介导的炎症反应而保护血脑屏障，从而减轻脑水肿和脑实质损伤，并提示重组ADAMTS13有可能为脑出血的治疗提供新的思路和策略。