NCX-钙预处理产生心肌保护作用的信号转导机制研究

钠钙交换体（NCX）-钙预处理产生心肌保护作用的信号转导机制仍不清楚，我们在前一基金的资助下发现，缺血预处理减弱缺血/再灌注期NCX反向交换模式的活性，减轻钙超载，表明NCX可能是缺血预处理重要的效应分子之一，但预处理调节NCX功能的机制尚未研究；AMP蛋白激酶（AMPK）/GLUT4是缺血预处理实现心肌保护的重要通路，但它是否是钙通路的下游分子还不明确；此外参与预处理的PKC-d是"保护分子"？还是"损伤分子"也亟待明确。本项目将采用心肌细胞收缩力检测、全细胞膜片钳记录等方法，观察预处理保护作用及其改变NCX交换特性的作用机制，研究预处理对AMPK/GLUT4和PKC-d活性的影响，以明确AMPK/GLUT4是否介导NCX-钙预处理保护，以及PKC-d在预处理期和缺血/再灌注期NCX-钙信号通路中的作用。阐明上述问题将有助于揭示心肌内源性保护的分子机理，为相关心血管疾病的防治提供新思路。

课题组前期工作表明，钠-钙交换体（NCX）-钙信号介导心肌预处理保护和缺血再灌注损伤，然而其作用机制并不清楚。本课题以离体大鼠心脏为研究对象，探讨腺苷酸激活的蛋白激酶（AMP-activated kinase, AMPK）和钙依赖蛋白酶（calpain）在NCX−钙信号中的作用。实验发现，无钙液预处理和缺血预处理显著增加AMPK活性，葡萄糖转运体4的细胞膜转位数量；在预处理期间给予AMPK抑制剂P5499、NCX抑制剂KB-R7943，及蛋白激酶C抑制剂chelerythrine后，预处理的保护作用均减弱，AMPK活性下降。提示，经PKC激活AMPK介导NCX-钙预处理保护。3 min无钙–30 min有钙液接替灌注引发钙超载心肌损伤（钙矛盾），表现为心功能障碍，组织细胞几乎全部死亡。Calpain的抑制剂MDL28710处理显著缩小心肌损伤面积，改善心功能；与MDL28710不同，NCX抑制剂KB-R7943显著下调挛缩指标LVEDP，同时伴随更强的细胞存活与收缩功能（以LVDP为检测指标）改善作用；延长无钙液灌注时间至5 min后，KB-R7943仍显著抑制calpain活性，缩小心肌损伤面积，但对LVEDP的作用消失，对LVDP的作用也消失。表明，calpain激活和挛缩发生是介导钙超载心肌损伤的两个相互独立因素，前者主要引起心肌死亡，后者削弱左室收缩功能。以上结果表明，NCX-钙信号通路在心肌保护与损伤中的作用机制不同，其中AMPK激活介导保护作用，calpain激活和挛缩发生介导心肌损伤。