凋亡相关基因PNAS-2特异性RNAi及胞内单链抗体表达病毒治疗白血病的实验研究

我们的前期研究发现凋亡相关基因PNAS-2在白血病细胞株及原代细胞中存在特异性的高表达，PNAS-2蛋白在白血病细胞株及原代细胞中还存在定位异常，并发现上述异常很可能参与急性白血病的发病。因此，抑制白血病细胞中高表达的PNAS-2和/或封闭异常定位的PNAS-2蛋白很可能对白血病有治疗作用。本课题主要研究RNAi慢病毒抑制白血病细胞中PNAS-2表达后对白血病细胞有无促凋亡作用；研究表达PNAS-2胞内单链抗体的逆转录病毒感染白血病细胞后能否中和、封闭细胞浆内异常定位的PNAS-2蛋白，并判断其能否促白血病细胞发生凋亡。通过本课题的研究，将进一步明确PNAS-2与白细胞发病的关系，并有可能为下一步开发相关的基因治疗药物打下基础。如能获得成功，在找到合适的载体后可能在临床上具有广泛的应用前景。

我们的前期研究发现凋亡相关基因PNAS-2（别名CHMP5）具有抗细胞凋亡作用，其在白血病细胞中存在高表达，上述发现得到了国外学者的验证。我们进一步的研究发现PNAS-2蛋白在白血病细胞中还存在亚细胞定位异常，并发现上述异常很可能参与急性白血病的发病。因此，抑制白血病细胞中高表达的PNAS-2 和/或封闭异常定位的PNAS-2 蛋白很可能对白血病有治疗作用。在本研究中，我们构建了PNAS2-RNAi慢病毒，在感染白血病细胞后发现该病毒可抑制白血病细胞中PNAS-2蛋白的表达，并促使白血病细胞株及原代细胞发生细胞凋亡。PNAS2-RNAi慢病毒促进白血病细胞发生细胞凋亡的机制为：通过Gran B/Perforin介导的Caspase依赖的细胞凋亡途径及AIF介导的非Caspase依赖的细胞凋亡途径促白血病细胞凋亡，而对经典的外源性细胞凋亡通路及细胞自吞噬没有影响。在研究PNAS-2胞内单链抗体（PNAS2-SCFV）的过程中，通过PCR及测序技术，从我们前期制备的能产生PNAS-2特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞KC14中，获得了轻链可变区及重链可变区的基因序列，之后构建PNAS-2 胞内单链抗体表达逆转录病毒。我们发现PNAS-2 胞内单链抗体表达逆转录病毒感染白血病细胞后可中和、封闭白血病细胞胞浆内异常定位的PNAS-2 蛋白，并促白血病细胞株及原代细胞发生细胞凋亡；其具体机制为PNAS2-SCFV逆转录病毒通过AIF介导的细胞凋亡途径促白血病细胞凋亡，而对内、外源性的细胞凋亡通路及细胞自噬没有影响。在动物实验部分研究中，实验分为PNAS2-RNAi病毒组、PNAS2-SCFV病毒组及对照组。PNAS2-RNAi慢病毒及PNAS2-SCFV逆转录病毒各自预先感染用于接种裸鼠的该组白血病细胞后，与对照组相比，PNAS2-RNAi病毒组及PNAS2-SCFV病毒组中白血病荷瘤鼠的瘤体更小，表明两种病毒均有抑制白血病细胞生长的作用。尽管PNAS2-RNAi病毒组白血病荷瘤裸鼠的瘤体的在三组中最小，但该组裸鼠的一般状况比对照组更差，提示尽管PNAS2-RNAi病毒对白血病治疗有效，但其对实验动物的副作用大，不适合用于基因治疗。而PNAS2-SCFV病毒不仅仅抑制了白血病荷瘤鼠瘤体的生长，而且PNAS2-SCFV病毒组裸鼠的一般状况好于对照组；提示仅仅抑制白血病细胞中异常定位的