紫花苜蓿小孢子培养技术的研究

In order to establish an efficient technique system of isolated microspore culture in alfalfa and accelerate the speed of breeding materials purity, isolated microspore culture was performed using alfalfa,the suitable shape of alfalfa bud and anther for microspore culture were obtained by observing the relationships between microspore stages and the modality character of alfalfa bud and anther .On the basis of alfalfa anther culture，besides,we learnt from the result of study of cruciferae vegetable, wheat and maize to screen the factors influencing the production rate of embryo,including the effects of pretreatment (low temperature，high temperature and starvation），types of medium，inoculum densityc，sucrose concentration，types and concentrations of hormone.Regenerated Plants were obtained in this study and their ploidy were detected by flow-cytometric analysis，then screened haploid plants,it can lay a foundation for study on cell engineering and genetic engineering.

为了获得较高比率的子叶型胚，以紫花苜蓿为研究对象，通过苜蓿的花蕾和花药的形态特征与小孢子发育时期的关系，以确定适宜进行小孢子培养的花蕾和花药的形态指标；在苜蓿花药培养的基础上，借鉴十字花科蔬菜作物以及小麦、玉米等作物的研究，筛选影响小孢子产胚率的因素，如预处理（低温、饥饿处理），培养基、蔗糖浓度，激素浓度，培养方式，同时研究离体小孢子的发育途径，为细胞工程、遗传工程研究奠定基础。

苜蓿为异花授粉植物，具有自交不亲和性，群体中个体的基因总是处于杂合状态，利用小孢子培养可以得到双单倍体（DH）植株，获得纯系。本试验研究了苜蓿小孢子发育时期与花器形态的相关性；低温、高温、饥饿等预处理条件对苜蓿小孢子存活率的影响；培养基种类及成分、培养方法等因素对苜蓿小孢子产胚率的影响。研究结果如下：. （1）紫花苜蓿和黄花苜蓿小孢子发育分为四个时期，分别为四分体时期、单核早中期、单核靠边期、双核期，且各时期有明显的细胞学特征；花蕾纵径和花瓣长在小孢子发育四个时期之间均表现极显著差异，其它花器形态指标只是部分时期之间差异显著，因此花蕾纵径和花瓣长适宜作为小孢子发育时期的判断依据；紫花苜蓿和黄花苜蓿小孢子处于单核靠边期时的花瓣微露出花萼，紫花苜蓿纵径长和花瓣长分别在5.40-6.10mm和3.98-5.55mm之间，而黄花苜蓿的纵径长和花瓣长的范围分别为3.61-4.32mm和2.68-3.61mm。. （2）紫花苜蓿花序预处理试验，采用B5液体培养基，4℃低温处理24h后，置于25℃条件下培养第1，2，3天小孢子存活率显著高于25℃的对照处理，处理1d存活率最高，为45.34%，3d后明显下降；33℃高温处理不同天数后，置于25℃条件下培养第3d时小孢子存活率均达最高，之后小孢子存活率都逐渐下降，但以33℃高温处理48h的下降最为缓慢；饥饿处理后1d小孢子存活率为29.16%，但与对照相比差异不显著。从以上结果来看，较好的预处理是4℃低温处理24h。. （3）紫花苜蓿游离小孢子的培养，将花药置于无蔗糖的B5液体培养基中4℃低温处理24h，选择单核靠边期的花蕾进行小孢子分离提纯，置于6-BA浓度为0.8mg/L，NLN培养基中进行固液双层培养，培养密度为1.5×105个/ml。培养16-18d出现胚状体，产胚率为17.88个/皿。