甲基转移酶KMT1A抑制剂的筛选及其靶向抑制膀胱癌干细胞的机制研究

The incidence of bladder cancer ranks first in urogenital neoplasms in China, but there are no specific and effective therapies. As the ideal target of the targeted therapy, bladder cancer stem cells (BCSCs) possess the characteristics of self-renewal, infinite proliferation and pluripotency, and are the source of bladder cancer tumorigenesis, progression, recurrence and metastasis. However, the self-renewal mechanisms of BCSCs remain unclear. Therefore, it is of great importance to clarify the mechanisms of stemness and screen of targeted inhibitors of BCSCs. Our previous studies uncovered that histone methyltransferase KMT1A was highly and specifically expressed in BCSCs. Moreover, depletion of KMT1A significantly abrogated self-renewal of BCSCs. In the proposed project, we plan to screen of a KMT1A inhibitor harboring the high-specificity and low side effects targeting to KMT1A in BCSCs with the tumor immunological and epigenetic methods. Furthermore, the optimal KMT1A inhibitor of BCSCs will be picked out with the evaluation of the inhibitory effects to BCSCs and bladder tumor, in vitro and in vivo. Finally, the inhibitory mechanisms of KMT1A inhibitor to BCSCs will be elucidated with the analysis of transcriptome and epigenomics of BCSCs. Collectively, the results of this project will illuminate the suppressive effects of KMT1A inhibitor targeting KMT1A in BCSCs and provide a theoretical and practical foundation to develop novel therapies targeted BCSCs.

膀胱癌的发病率在我国泌尿系统肿瘤中高居第一位，目前尚无特异有效的治疗方法。膀胱癌干细胞作为靶向治疗的最佳选择，具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能，是膀胱肿瘤发生、发展、复发和转移的根源，但膀胱癌干细胞自我更新的分子机理仍不清楚。因此，阐明其干性维持的分子作用机制和筛选获得其靶向抑制剂具有重要意义。我们前期研究发现组蛋白甲基转移酶KMT1A在膀胱癌干细胞中的高表达具有特异性，当其功能缺失后，膀胱癌干细胞的干性维持被严重破坏。在此基础上，本项目以膀胱癌干细胞中高表达的KMT1A作为抑制靶点，采用肿瘤免疫学和表观遗传学等方法筛选特异性强、毒副作用小的KMT1A抑制剂；评估其靶向抑制膀胱癌干细胞和膀胱肿瘤的效果，确定膀胱癌干细胞的最佳KMT1A抑制剂；揭示其抑制膀胱癌干细胞的作用机制。本项目的完成将阐明靶向KMT1A对膀胱癌干细胞的抑制效果，为发展靶向干预膀胱癌干细胞的新治疗手段提供理论依据。

膀胱癌干细胞具有自我更新、分化、转移、耐药和高致瘤性等特征，被认为是膀胱癌复发的根本因素。前期研究工作中，我们发现KMT1A-GATA3-STAT3轴驱动BCSCs的自我更新，组蛋白甲基转移酶KMT1A在膀胱癌干细胞中的高表达具有特异性，是首个膀胱癌干细胞特异性标志物。然而，KMT1A抑制剂对BCSCs的作用效果仍不清楚。.本项目以膀胱癌干细胞为研究对象，首先分析了KMT1A在膀胱癌（干）细胞中的表达量。组学分析、荧光定量PCR和western blot实验结果表明，KMT1A的mRNA和蛋白在膀胱癌中的表达量显著高于癌旁组织（2.85倍）、并显著富集于膀胱癌干细胞（3~5倍）；不仅如此，KMT1A的表达量与膀胱癌病理分期分级呈正相关性（p < 0.01），KMT1A表达量越高的患者，生存时间越短（p < 0.05）。第二部分鉴定了6种KMT1A的抑制剂（AMI-1，BIX-01294，毛壳素，DZNeP，GSK343和UNC0631）对膀胱癌干细胞和正常膀胱上皮细胞增殖的作用效果。其中，毛壳素能够显著抑制膀胱癌干细胞的增殖（抑制率：65%-88%，IC50值为：24.4-32.5 nM），但对正常膀胱上皮细胞无明显影响。第三部分探究毛壳素对膀胱癌干细胞凋亡和周期的作用效果。与对照组相比，毛壳素能够显著诱导膀胱癌干细胞发生凋亡（2-5倍），并导致膀胱癌干细胞周期G1期阻滞（68.9% vs 55.5%），但对正常膀胱上皮细胞无明显影响。第四部分探明毛壳素破坏膀胱癌干细胞干性维持、抑制膀胱癌肿瘤形成的效果。体内实验结果表明，毛壳素能够显著抑制肿瘤的生长（抑制率：71%-82%）且延长荷瘤小鼠的生存时间（70天 vs 53天）。最后利用荧光定量PCR、western blot和染色质免疫共沉淀等实验方法，揭示了毛壳素通过靶向KMT1A-GATA3-STAT3、GLI1、SOX2和CD44等干性相关信号通路，显著抑制了膀胱癌干细胞干性维持和致瘤能力。.综上，本项目阐明了毛壳素抑制膀胱癌干细胞的分子机理，为其在膀胱癌干细胞靶向治疗领域的应用奠定理论基础。