兽疫链球菌谷氨酰胺代谢对透明质酸合成调控机理的研究

Hyaluronic acid (HA) biosynthesis pathway and related genes in Streptococcus equi subsp. zooepidemicus have been thoroughly studied, and the rate-limiting reaction is the synthesis of glucosamine-6-phosphate. The source of amino groups in this reaction is glutamine. A mutant library was constructed and screened for the bacterial capsule defect strain. Through gene knockout and plasmid rescue, the glutamine synthetase gene glnA disruption leads to capsule biosynthesis, but the underlying mechanisms are not clear. In this proposal, we will perform the following work: (1) through EMSA, DNase Ⅰ footprint assay, qPCR, enzyme activity assay and other experiments, the nitrogen regulatory protein GlnR effects on glnA and glutamine transportor gene glnPQ transcriptional regulation and GlnA effects on GlnR activity will be explored; (2) the corresponding overexpression strains and gene knockout strains will be constructed, and GlnR, GlnA, GlnP and GlnQ effects on the regulation of glutamine and HA biosynthesis will be determined; (3) the other glutamine metabolism pathway effects on HA biosynthesis. This work will reveal the functions of the genes in glutamine metabolism pathway and the molecular mechanisms of these genes effects on HA biosynthesis and molecular control, and provide the theoretical basis for rational modification of S. zooepidemicus to produce high quality HA.

兽疫链球菌透明质酸合成途径和相关基因已研究地比较透彻，其中由谷氨酰胺提供氨基合成葡萄糖胺-6-磷酸是透明质酸合成的限速反应。前期通过构建突变体库发现谷氨酰胺合成酶基因glnA影响透明质酸荚膜的合成，但机制尚不清楚。本课题拟开展：（1）通过凝胶迁移、DNase Ⅰ足迹、qPCR、酶活检测等实验，研究全局性氮源调控蛋白GlnR对谷氨酰胺合成酶操纵子glnRA和谷氨酰胺转运蛋白操纵子glnPQ的转录调控作用，以及GlnA协同GlnR执行转录调控作用的机制；（2）构建过表达菌株和通过无痕敲除技术构建相应基因突变菌株，研究GlnR、GlnA和GlnP、GlnQ对胞内谷氨酰胺水平和透明质酸合成及分子量的影响；（3）谷氨酰胺参与其他代谢途径对透明质酸合成的影响。以上研究将揭示谷氨酰胺代谢相关基因功能对透明质酸合成和分子量的影响，为理性改造兽疫链球菌生产高品质透明质酸奠定基础。

本研究以转录因子家族成员基因rgg为研究对象，旨在阐明rgg参与兽疫链球菌群体感应的作用机制，并探究其对菌体生长、透明质酸合成的影响。主要研究内容如下：.（1）Rgg转录调控基因和信息素基因shp作用机制的研究。实验构建了由rgg，Pshp和荧光素酶基因luc三部分元件组成的报告质粒pLH465，将其转入异源表达宿主变形链球菌后，通过添加信息素多肽，检测荧光素酶基因的活性来反映shp的表达效果。实验结果表明：shp能够编码一种活跃的信息素，当rgg基因响应于活性SHP信息素时，可以起转录激活因子的作用以激活shp的表达。.（2）Rgg和shp基因功能的研究。实验围绕rgg和shp，构建了∆rgg、∆shp、∆rgg∆shp、rgg/OP、shp/OP等突变菌株，检测它们在相同发酵培养条件下生长和透明质酸含量。结果表明这反映了rgg-shp信号通路作为功能性自诱导系统，在菌株生长代谢和透明质酸的形成中发挥着重要的调节作用。.（3）兽疫链球菌中rgg-shp信号通路的研究。实验以上述研究为基础，构建∆rgg∆shp/pLH465，∆rgg∆shp/pLH505等菌株，检测荧光素酶活性，验证了rgg-shp确实是兽疫链球菌中的功能性自诱导系统，参与菌株的群体感应。.（4）兽疫链球菌群体感应与生物膜的研究。实验以∆rgg、∆shp、∆rgg∆shp、rgg/OP、shp/OP五株菌株为出发菌，通过特定的培养条件培养菌体生物膜并检测其生成量的差异，实验结果表明，外源添加信息素多肽XIP-2至野生型和∆rgg∆shp等突变株中不会引起生物膜形成的明显变化，而添加至∆shp菌株时恢复了部分生物膜形成的能力，这表明rgg-shp信号通路在参与群体感应时影响了菌株生物膜的形成。.（5）ΔglnR后，菌株生长放缓，透明质酸合成水平下降。