抗多重耐药结核分枝杆菌高活性化合物作用机制的研究

There is an urgent need for developing the new drugs against multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MTB) currently. Our previous work showed that a small molecular compound named IMB-YH-8 can inhibit the activity of PknB in vitro,which is one of 11 eukaryote-like serine/threonine protein kinases encoded by MTB, and strongly inhibit the growth of multi-resistant MTB isolated from clinic samples (MIC 0.25μg/ml). Although the compound exhibits a great potential for the development of ani-MTB drug, the detail mechanism of its action remains unclear. In this proposal, we will 1) characterize the interaction of IMB-YH-8 and PknB using experimental approaches including surface Plasmon resonance(SPR),Isothermal titration calorimetry (ITC) and molecular docking; 2) investigate the inhibitory effect of IMB-YH-8 upon other MTB Pritein kinases similar to PknB; 3) explore other potential mechanism of action of IMB-YH-8 based on analysis of gene expression profiles, chemical proteomics and bioinformatics. In summary, this work will lead toward the development of new drugs against multi-resistant Mycobacterium tuberculosis.

多重耐药（MDR）和超级耐药（XDR）结核杆菌的出现，使得结核病又回到了前抗生素时代，已有近40年来未发现新抗结核药物。因此，加紧研发高效抗结核药物迫在眉睫。前期工作发现化合物IMB-YH-8对结核分枝杆菌生长所必需的PknB具有抑制活性，体外抗多重耐药结核分枝杆菌MIC达到0.25μg/ml，且与异烟肼、利福平等均不产生交叉耐药。 尽管化合物IMB-YH-8 具有开发成抗耐药结核新药的潜质，但其靶点确认和作用机制还需深入研究。本申请1）首先采用SPR、ITC、分子对接等方法研究IMB-YH-8与PknB之间的相互作用；2）然后，研究该化合物对MTB中PknB类似激酶的抑制活性并进行靶点确认；3）同时采用化学基因组学、化学蛋白组学以及生物信息学等技术深入揭示活性化合物其它潜在的药物靶标以及作用机制。此研究结果将为抗结核新药的研发提供新的理论依据。

近年来耐药结核分枝杆菌的出现和广泛流行，使得结核病成为全球最致命的传染病之一。目前结核病的治疗面临诸多挑战，抗结核药物研发相对迟缓，已有的药物不能满足治疗的需要，因此，研发新型抗结核药物迫在眉睫。实验室前期利用结核分枝杆菌PknB抑制剂高通量筛选模型获得了具有体外强抗结核分枝杆菌活性的阳性化合物IMB-YH-8。. 本研究首先进行了化合物IMB-YH-8抗结核分枝杆菌作用机制研究，确证了结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的是先导化合物IMB-YH-8发挥抗结核活性的重要靶点之一，其中以PknB为主要靶点，其次为PknA。体外实验发现IMB-YH-8能够抑制PknB酶的自身磷酸化，并可剂量依赖性地抑制PknB底物蛋白GarA的磷酸化。表面等离子共振实验和等温滴定量热法体外分析证实了IMB-YH-8和PknB之间存在着中等强度的直接相互作用。分子对接结果显示其与PknB催化结构域的Val95可形成氢键，并预测了它与靶蛋白的结合模式。扫描电镜观察发现IMB-YH-8能引起结核分枝杆菌细胞形态的改变和细胞壁的破损。多种组学研究结果进一步表明，IMB-YH-8通过抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，可明显降低分枝杆菌蛋白中被磷酸化的氨基酸位点及被磷酸化蛋白的数量，进而导致其磷酸化底物及相关蛋白基因在转录水平和翻译水平上的差异。靶标捕获研究结果显示，除丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknB和PknA以外，IMB-YH-8还存在着其他作用靶点。. 本研究还通过计算机辅助药物设计进行化合物的结构优化和构效关系分析、设计合成了一系列IMB-YH-8衍生物，并完成了其抑酶和抗菌活性评价。研究结果表明化合物结构中羰基反式碳碳双键共轭结构是该类化合物具有活性的必需基团。衍生物中酯类和N,N=二取代酰胺类化合物普遍具有较好的抗结核分枝杆菌活性，其抗结核分枝杆菌活性强弱依次为甲酯类>乙酯类>异丙酯类>N,N-二取代酰胺类，羧酸、未取代酰胺、Boc氨基乙酯和酰肼类化合物无抗结核分枝杆菌活性。本研究共获得301个IMB-YH-8衍生物，其中多个化合物的活性强于或与先导化合物IMB-YH-8活性相当。