高效低免疫原性黄精凝集素分子设计与验证

Polygonatum cyrtonema lectin (PCL) bears specific anti-HIV and anti-tumor activities with extremely low toxic side effects. However, exogenous medical protein may cause immunogenicity and produce neutralized antibodies after entering the body, which might result in drug-resistant problem. Based on previous numerous studies, this application subject aims at resolving the problems about immunogenicity and drug-resistant in future in vivo application of PCL, and screening Chinese-related advantage T cells antigen episode and key amino acid residues of PCL following by remodeling antigen episode of PCL by site-directed mutagenesis further. All these experiments would be performed by structure bioinformaticis, protein engineering technology and etc, and by the analyses and identifications of representative Chinese T cells in response to candidate peptides response, PCL would be remodelled. The decreased or deleted immunogenicity and remained or changed anti-tumor activity of PCL would be identified by recombinant expression, purification combination mutant, antigen-antibody combination and in vitro as well as in vivo determination of PCL. On the basis that the immunogenicity of PCL was reduced or eliminated while its anti-tumor activity was remained, new anti-tumor drugs with low or void immunogenicity would be created that would open the perspective of novel drugs development and its future application.

黄精凝集素具有特异抗HIV等病毒和抑制肿瘤细胞增殖活性以及很低的毒副作用，显示出良好的成药性；鉴于外源药用蛋白可能的免疫原性，进入体内易产生中和性抗体而影响疗效，甚至产生耐药性问题。本申请课题针对黄精凝集素未来体内应用可能面临的免疫原性等问题及耐药性问题，在前期研究基础上结合其高分辨率晶体学结构数据，拟综合运用结构生物信息学方法和蛋白质工程等技术手段，通过分析具有我国人群代表性的T细胞系列候选表位多肽，筛选黄精凝集素中与我国人群相关的优势T细胞抗原表位及关键氨基酸残基，进一步通过定点突变技术改造黄精凝集素分子中的细胞抗原表位。重组表达、纯化组合突变体，通过抗体结合分析及细胞和动物体内实验，确认黄精凝集素免疫原性的降低（或去除）和抗肿瘤抗病毒活性的保留(或变化），在保持活性的基础上减低(或消除)其免疫原性，为最终创制新一代具自主知识产权、低(或无)免疫原性的创新药物及其未来可能的应用打下基础

黄精凝集素（Polygonatum cyrtonema Hua. lectin，PCL）是低毒高效的具有抑制肿瘤细胞增殖活性、抗HIV等病毒活性的甘露糖特异结合蛋白，显示出良好的成药性。但作为外源蛋白，其进入体内易产生中和性抗体而影响疗效，甚至产生耐药性。为在不影响其生物学活性的基础上降低其免疫原性，本研究结合黄精凝集素高分辨率晶体学结构数据，运用结构生物信息学方法、生物化学和分子生物学技术手段，通过分析在黄精凝集素的氨基酸序列中与免疫相关的T细胞和B细胞抗原表位，筛选出了黄精凝集素氨基酸序列中与我国人群相关的5条T细胞抗原表位多肽和2条B细胞抗原表位多肽，根据生物信息的分子对接方法进行打分计算，选择4个关键氨基酸残基（V18，G19，P20，P100），利用定点突变技术将其分别突变为 C18，Q19，H20，S20，R100，从而改造黄精凝集素分子中的细胞抗原表位。首先分别设计5个单一突变位点， mrPCL1-V18C，mrPCL2-G19Q，mrPCL3-P20H，mrPCL4-P20S，mrPCL5-P100R。采用原核表达系统对野生型PCL及所有突变体进行重组表达与纯化，获得野生型及突变黄精凝集素。黄精凝集素第二、第三结合位点的回复突变表明凝集素甘露糖结合能力升高，其抗肿瘤细胞增殖活性也随之增强。 .通过活性实验及细胞实验，对比突变蛋白，确认第一个突变体(mrPCL1)和第二个突变体(mrPCL2)相比野生型黄精凝集素的凝集活性及抑制肿瘤细胞活性有所下降，但理化性质稳定，其中，第二个突变体(mrPCL2)相比第一个突变体(mrPCL1)体外抑制肿瘤细胞活性更强。将制备的多克隆抗体用于检测不同类型PCL突变蛋白，野生型和突变型黄精凝集素的Western blot 检测和ELISA检测显示， 野生型和突变体均能结合抗体，但ELISA检测发现，突变体与抗体的结合能力显著下降。.鉴于第二个突变体(mrPCL2)体外抑制肿瘤细胞活性更强以及其与抗体结合能力下降，在此基础上，将第二个单一位点突变作为组合突变的位点首选，再结合与糖结合活性和抑制肿瘤细胞增殖活性相关的位点进行组合突变。结合上述研究结果，进行了黄精凝集素糖结合位点的回复突变与第二个突变体(mrPCL2)的组合突变，抗体结合及肿瘤细胞增殖实验发现组合突变体的抗体结合能力大幅下降，但其体外抑制肿瘤细胞增殖活性增