黄精凝集素II诱导肿瘤细胞自噬和凋亡的分子机制研究

在黄精凝集素II（PCLII）前期体内抗肿瘤活性动物实验和体外抑制肿瘤细胞自噬和凋亡作用机制及信号通路部分蛋白相互作用网络研究的基础上，拟采用荧光标记PCLII和激光共聚焦显微镜示踪，分析其在细胞表面和内部的定位、结合与运动情况；利用凝集素亲和层析技术结合双向电泳和质谱分析，分离、鉴定并分析肿瘤细胞膜表面和内膜系统的PCL II受体；研究死亡受体途径相关信号通路在肿瘤细胞自噬和凋亡中的作用以及与线粒体途径的关系；选取部分除已知的与PCLII自噬相关基因外的其它自噬相关基因，研究其在PCL II诱导的肿瘤细胞自噬和凋亡中的作用以及蛋白质间的相互作用。在此基础上，利用系统生物学手段，基于前期建立的人类肿瘤细胞自噬和凋亡相关蛋白相互作用网络，结合实验研究结果，进一步构建和完善与黄精凝集素II诱导肿瘤细胞自噬和凋亡相关的信号通路蛋白质相互作用网络，为深入揭示PCL II抗肿瘤机制奠定基础

采用荧光标记黄精凝集素（PCLII）和激光共聚焦显微镜示踪，分析该凝集素与肿瘤细胞的结合以及在细胞表面和内部的定位、结合与运动情况，发现该凝集素可以与细胞表面的受体结合，同时可以通过内吞（内化）作用进入细胞内，分布于线粒体、内质网、溶酶体、高尔基和细胞核等处。制备细胞膜和相关细胞器（线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体等）蛋白及膜蛋白，利用凝集素亲和层析技术结合双向电泳和质谱分析，分离、鉴定并分析肿瘤细胞膜表面和内膜系统的PCL II受体和结合蛋白， 发现凝集素可以结合与细胞骨架结构、细胞周期、细胞凋亡、自噬、抗凋亡、内质网应激反应、免疫反应、代谢通路相关的蛋白，包括EGFR、TNFR1、TGFR、肿瘤抑制蛋白P53、P21、P38等、热休克蛋白Hsp(90,70,60)，整合素integrin(a6, aV)，胰岛素受体、磷脂结合蛋白(膜联蛋白)annexin( A2,A4)等。在此基础上选择表皮生长因子受体(EGFR)相关信号通路进行分析，发现黄精凝集素通过阻碍Ras-Raf和PI3K-Akt信号通路诱导细胞的凋亡和自噬。Ras-Raf信号通路在黄精凝集素诱导的细胞凋亡中起到关键性的负调控作用，在肿瘤细胞自噬中同样起到负调控作用。进一步研究发现，该凝集素可以调控p21(周期依赖性蛋白激酶的抑制剂)的上调表达以及Cdk1和cyclinA表达下调，通过Cdk1-cyclinA信号通路阻滞G2/M细胞周期诱导肿瘤细胞程序性死亡。这些关键线索为进一步阐明黄精凝集素诱导的癌细胞死亡的复杂分子机制从而应用于将来的癌症治疗提供了重要的证据。基于上述实验结果，综合前期黄精凝集素抑制肿瘤细胞增殖的相关研究，建立了黄精凝集素诱导肿瘤细胞凋亡和自噬相关信号通路蛋白质相互作用网络图，为进一步集成利用蛋白质组学等技术系统阐述该凝集素的作用机制奠定了坚实的基础。. 结合miRNA调控肿瘤发生发展关键蛋白的研究进展，研究工作中增加以凝集素为探针，研究凝集素与miRNA相互作用调控肿瘤细胞程序性死亡的研究内容。利用芯片分析技术分析鉴定了部分与黄精凝集素诱导肿瘤细胞程序性死亡相关的miRNA，初步建立起凝集素探针-肿瘤细胞程序性死亡相关蛋白-miRNA相互调控网络。