看麦娘对甲基二磺隆代谢抗性相关基因鉴定与功能分析

Shortawn foxtail (Alopecurus aequalis) is one of the main weeds infesting in wheatfields. Mesosulfuron-methyl is the most widely applied herbicide for the control of shortawn foxtail. Unfortunately, in recent years, many shortawn foxtail populations have been reported to evolve resistance to mesosulfuron-methyl. Previous study indicated that P450s and/or GSTs mediated enhanced mesosulfuron-methyl metabolism is a powerful mechanism for herbicide resistance in shortawn foxtail. However, the metabolic resistance genes confer herbicide resistance in shortawn foxtail remain unknown. In previous work, we have obtained the sensitive biotype and the resistant biotype which has evolved metabolism resistance to mesosulfuron-methyl. With these valuable materials, the RNA-Seq and iTRAQ will be utilized to screen the potential resistance genes. The expression of potential resistance genes will be analyzed by qRT-PCR to obtain key genes involved in metabolism resistance, and to reveal the expression characterize of key genes. Then, transgenic and knockout technology will be used to verify the function of key genes to confirm the resistant gene and characterize the resistance patterns to different herbicides. This study will identify the genes responsible for metabolic resistance and preliminarily illustrate the molecular basis of metabolism-based mesosulfuron-methyl resistance in shortawn foxtail. These results have important theoretical significance for the monitoring and controlling of herbicide-resistant shortawn foxtail. In addition, the identified resistant genes will provide resource for crop breeding and making new strategy for weed management.

看麦娘是我国麦田主要危害杂草之一，甲基二磺隆是防治看麦娘的重要除草剂品种。近年来，看麦娘对甲基二磺隆抗性发展迅速，严重影响小麦产量。前期研究发现代谢酶P450s、GSTs活性增强介导了看麦娘对甲基二磺隆的代谢抗性，但代谢抗性的功能基因尚未明确。项目拟以甲基二磺隆代谢抗性和敏感看麦娘为材料，采用RNA-Seq结合iTRAQ筛选潜在抗性基因；利用qRT-PCR分析潜在抗性基因除草剂胁迫前后的表达量差异以及代谢酶抑制剂对转录水平的影响，以确定关键抗性基因，并明确基因表达量与甲基二磺隆诱导的关联性；利用转基因和基因敲除技术验证关键基因功能，以明确抗性基因及其导致的抗性模式。上述研究结果可分离鉴定具有重要应用价值的抗性基因，探索看麦娘对甲基二磺隆代谢抗性的分子机理，为看麦娘抗性监测及治理提供理论依据。获得的抗性基因可为抗除草剂作物育种以及农田杂草绿色防控策略的构建提供基因资源。

看麦娘是我国麦田主要恶性禾本科杂草之一，目前已经对甲基二磺隆等重要除草剂产生了高水平抗性，严重影响小麦产量。增强的除草剂代谢，即代谢抗性是看麦娘对甲基二磺隆产生抗性的原因之一。本项目以对甲基二磺隆具有显著代谢抗性表型的看麦娘种群AH-18为研究对象，利用传统的植物生理学和分子生物学手段，挖掘关键的除草剂抗性功能基因，并探索其代谢抗性产生的机理，以期为抗性杂草诊断和作物遗传育种提供潜在基因资源，并为解析杂草对特定除草剂的代谢抗性机理提供一定借鉴。本研究主要结果如下：1. 看麦娘代谢抗性表型验证：相比敏感种群，抗性种群GSTs解毒酶活性更高；抗敏种群在除草剂吸收方面无显著差异，但是抗性种群对甲基二磺隆的代谢速率更快。2. 除草剂解毒酶相关基因筛选：转录组学分析共鉴定到31个代谢抗性相关候选基因在抗性植株中上调表达，以CAP、EIF4A、TUB为组合内参进行荧光定量PCR验证，发现与转录组测序结果一致的基因共有17个，包括4个P450s、2个GSTs、2个GTs、2个ABC transporters和7个与水解、氧化、植物胁迫生理相关的基因。3. 组学关联分析筛选除草剂解毒酶候选基因：蛋白质组学分析共筛选到22个代谢抗性相关蛋白在抗性植株中具有更高表达丰度，包括1个酯酶、4个GSTs、2个GTs、3个ABC transporters和其它12个与氧化、过氧化、还原等过程相关的酶，其中1个酯酶、2个GSTs和1个GT在转录组学和蛋白组学分析中均上调表达。4. 除草剂解毒酶关键基因鉴定：过表达CYP709C56、GSTF1和GSTU1能够赋予野生型拟南芥对甲基二磺隆的耐药性/抗药性，且其抗药性表型与基因表达水平具有相关性；CYP709C56过表达株系对甲基二磺隆和啶磺草胺产生了交互抗性，GSTF1过表达株系对甲基二磺隆和氟唑磺隆产生了交互抗性，而GSTU1过表达株系仅对甲基二磺隆表现出抗性。5. 关键候选基因功能分析：离体蛋白活性试验表明，CYP709C56和GSTU1表现出甲基二磺隆降解活性，二者可能分别通过催化O-脱甲基和与GSH扼合进行甲基二磺隆解毒；同源模建和分子对接对上述解毒酶关键催化位点进行了预测。