播娘蒿对苯磺隆抗性水平差异机理研究

Flixweed (Descurainia sophia) is one of the most infestive weeds in winter wheat fields in China. Tribenuron-methyl is the effective herbicide to control flixweed. However, flixweed has evolved resistance to tribenuron-methyl. Recent studies had demonstrated the resistant basis of flixweed to tribenuron-methyl. In our previous studies, the difference of resistance-level of flixweed to tribenuron-methyl was significant. In addition, we identified many different resistance-level flixweed biotypes from wheat fields. Nevertheless, the mechanism of flixweed induced different resistance-level to tribenuron-methyl has not been elucidated. In this study, we will test the activty of acetolactate synthase(ALS), cytochrome P450 monooxygenase and glutathione-S-transferase in different flixweed biotypes to explore the relationship between the enzymes activity(target-site enzyme and detoxification enzymes) and resistance-level of flixweed to tribenuron-methyl. Furthermore, Southern blot hybridization and PCR will be used to detect the number of ALS genes and clone the ALS genes, respectively. Moreover, the amino acid sequece of ALS will be analysed to ascertain the affect of ALS mutation polymorphisms and types on the resistance-level of flixweed to tribenuron-methyl. The key ALS mutation sites confering the resistance-level of flixweed to tribenuron-methyl will be identified by correlation analyse. At last, ALS gene expression differences in different resistance-level flixweed biotypes will be measured by fluorescence quantitative PCR. The findings will explain resistance-level difference mechanisms of flixweed to tribenuron-methyl, and provide theoretical reference to resistant weeds control.

播娘蒿是小麦田恶性杂草之一。苯磺隆是防治播娘蒿的有效除草剂，但播娘蒿对苯磺隆已产生了抗药性，以往研究明确了抗性产生的机理。本研究组发现，播娘蒿对苯磺隆抗性水平存在显著差异，筛选到多个不同抗性水平的生物型，然而这种抗性水平差异产生的机制尚未见报道。本研究通过测定不同抗性水平播娘蒿乙酰乳酸合成酶（ALS）、细胞色素P450单加氧酶、谷胱甘肽-S-转移酶的活性，明确播娘蒿体内靶标酶和解毒代谢酶的活性与抗性水平之间的关系；采用Southern杂交技术，明确播娘蒿体内ALS基因拷贝数，结合PCR技术克隆不同抗性水平播娘蒿ALS基因；通过分析不同抗性播娘蒿ALS序列，阐明ALS多态性及突变类型对抗性水平的影响，利用关联分析鉴定出起决定作用的差异位点；利用荧光定量PCR技术，明确播娘蒿抗性水平与ALS基因表达量之间的关系。本研究将解析播娘蒿对苯磺隆抗性水平差异产生的机制，为抗性杂草治理提供理论依据。

播娘蒿对苯磺隆产生了不同的抗性水平，本研究通过测定不同抗性水平播娘蒿种群的ALS、cytP-450、GSTs等关键酶的活性，明确靶标酶、解毒代谢酶的活性与抗性水平之间的关系；通过ALS基因克隆及序列分析，确定与抗性产生有关的ALS基因，阐明ALS多态性对抗性水平的影响；利用荧光定量PCR技术，解析播娘蒿抗性水平与ALS基因表达量之间的关系。本研究的结果如下：.（1）ALS序列分析发现，播娘蒿抗性种群中存在多个ALS突变位点，分别为ALS 196位由缬氨酸（V）突变为了丙氨酸（A）、197位由脯氨酸（P）分别突变为了丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、组氨酸（H）、亮氨酸（L），199位由精氨酸（R）突变为了L、200位由蛋氨酸（M）突变为了V、376位由天冬氨酸（D）突变为了谷氨酸（E），574位的由色氨酸（W）突变为了R或L，其中196位与200位氨基酸突变需进一步验证，199位氨基酸突变首次在抗性杂草中发现，376位和574位氨基酸突变首次在抗性播娘蒿体内发现。. 播娘蒿ALS突变位点与抗性水平关系分析表明，ALS 574位或ALS保守区发生双突变的种群，其抗性水平较高，抗性倍数均在5000以上； ALS197位突变为S或T，或ALS376位突变为E时，抗性水平低于ALS 574突变或ALS发生双突变的种群。.（2）采用Southern杂交法、地高辛标记杂交法及结合ALS基因克隆结果，明确播娘蒿体内ALS基因有2个拷贝，编码区长度分别为1998 bp和2004 bp，在抗性种群中只检测到其中之一发生突变与播娘蒿对苯磺隆的抗性产生有关。.（3）采用荧光定量PCR技术，成功开发了18SrRNA、UBC和ACT7三个适用于研究播娘蒿基因表达水平变化的内参基因。以ACT7作为内参基因，对不同抗性播娘蒿种群ALS基因表达量分析表明，抗性水平大小与ALS基因表达量无关。.（4）播娘蒿对苯磺隆的抗性水平与ALS相对活性、cytP-450解毒代谢活性有关，与GSTs活性无关。播娘蒿的抗性水平大小与ALS相对活性大小呈正相关，与cytP-450的代谢能力增强有关。. 本研究阐明了播娘蒿抗性水平差异产生的机理，丰富了杂草抗性机理，为建立播娘蒿防控技术、减缓抗性水平的发展提供理论依据。