青藏高原牦牛粪便中捕食线虫真菌多样性及生防评价

家畜寄生线虫对畜牧业造成严重的损失，生物防治是安全、有效的首选措施之一。本项目拟调查青藏高原不同地区，不同海拔牧场牦牛粪便中寄生线虫的天敌捕食线虫真菌资源；结合海拔、温度、牧草等因子，系统分析这类真菌资源在牦牛粪便中的生物多样性特征；采用多序列（28S rDNA序列，ITS全序列和β-tublin1序列）综合分析方法对不同牧场土壤及牦牛粪便中的捕食线虫真菌进行系统亲缘关系分析；以对线虫的捕食能力及抗消化能力为筛选指标，从收集的资源菌株中筛选出2-3株具有生防潜力的菌株；通过设计特异性引物探针，通过荧光定量PCR方法分析目标生防菌耐动物消化能力及对寄生线虫的体内防治效果。本项目有助于揭示特殊生境下家畜寄生线虫的生防真菌的分布特征，研究结果将极大的丰富动物寄生虫生防资源，为家畜寄生虫防治提供理论基础和物质材料，促进畜牧业发展。

本项目在国家基金的资助下，按照申请书设计的方案对青藏高原不同地区，不同海拔牧场牦牛粪便中寄生线虫的天敌捕食线虫真菌资源进行了调查；结合海拔、温度、牧草等因子，系统分析这类真菌资源在牦牛粪便中的生物多样性特征；采用多序列（28S rDNA序列，ITS全序列和β-tublin1序列）综合分析方法对不同牧场土壤及牦牛粪便中的捕食线虫真菌进行系统亲缘关系分析；以对线虫的捕食能力及抗消化能力为筛选指标，从收集的资源菌株中筛选出3株具有生防潜力的菌株；通过设计特异性引物探针，通过荧光定量PCR方法分析目标生防菌耐动物消化能力及对寄生线虫的体内防治效果。项目按计划圆满结束，获得了青藏高原牦牛粪便捕食线虫真菌的第一首资料，目前大部分数据已经整理完成。研究结果表明：1、从多样性指数看，各个牧场土样及粪便中物种多样性指数（H′）有差异，低海拔牧场土样中捕食线虫的出现频率比高海拔牧场出现频率高，这个结果和国内外研究者（Su et al. 2007,Fowler,1970,Saumell and Padilha,2000,张克勤,1989,刘杏忠,1993）所做的结果是一致的；同样的，由于粪便中捕食线虫的出现和动物生活环境如海拔、温度、植被植物组成密切相关，因此也出现类似的结果，即低海拔牧牦牛粪便中捕食线虫的出现频率比高海拔牧场出现频率高。2、捕食线虫真菌的系统亲缘关系分析：采用引物ITS5、ITS4、Btla、Btlb、 Bt2a、Bt2b。分别扩增捕食线虫真菌的18S rDNA 和ITS全序列和β-tublin1序列；序列比对采用软件BioEdit和Clustal X 1.83；系统树构建及物种间亲缘关系分析采用软件MrBayes 3.0b4对来自牦牛粪样及粪样周围土壤菌株进行了亲缘关系分析。通过分析比对，发现来自粪便及土壤样品中的相同物种的菌株某些枝上存在亲缘关系。3、生物防治评估：对云南大理花甸坝牧场、云南迪庆纳帕海及白马雪山牧场采集的少孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）、弯孢节丛孢（A. musiformis）、椭圆隔指孢（Dactylellina ellipsospora）采用盐酸胃蛋白酶处理筛选耐受菌株，并进一步比较了耐受菌株的捕食活力，其中大理花甸坝和纳帕海的A. oligospora及白马雪山牧场的Dac. ellipsospora显示出较强的捕食