太平洋鳕鱼cathelicidin免疫功能基因的克隆与表达及其结构与功能研究

Cathelicidin(CATH)是生物体基因编码的自身免疫防御系统的重要肽类，在探讨免疫疾病发病及分子遗传机制等方面发挥了重要作用。最近，我们从北方海域主要经济鱼类之一的太平洋鳕(Gadus macrocepha)脾脏cDNA文库中成功克隆了两条CATH功能基因，为国内外首次，且为国内唯一发现的鱼类CATH。约800bp片段涵盖完整CDS，其编码的61个氨基酸的成熟肽含有多个RGS结构域，与已知的哺乳类，鸟类等CATH家族差异显著。本项目将继续鳕鱼CATH基因的筛选、克隆，为深入了解鳕鱼抗感染免疫的分子基础，研究CATH的进化历程, 进一步阐述CATH免疫相关基因进化上的生物关联性和变异性提供实物依据。并希望通过表达及分子改造，深入研究其成熟肽及衍生物的高级结构及in vitro和in vivo活性，为海洋创新药物的研制提供先导化合物，并为海水养殖病害生物学防治提供理论物质基础。

Cathelicidins是动物体内具有多功能的宿主防御肽家族，目前在几乎所有种类的脊椎动物体内均有发现。不仅具有强大抗微生物活性，cathelicidins还具有趋化免疫细胞、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡等活性，与多种免疫疾病的发病机制有关。 细鳞鱼（Brachymystax lenok），国家二级保护动物，隶属鲑科细鳞属，冷水性鱼类，我国只存在一种，主要分布于我国的东北和秦岭一带。我们提取了细鳞鱼脾脏RNA,构建了cDNA文库；并使用RACE加半巢式PCR的方法，从脾脏cDNA文库中克隆得到一种新型cathelicidin：CATH_BRALE。CATH_BRALE 的前体包含199个氨基酸，理论等电点（pI）为12.43，理论MW为5.2006 kDa，含有15个碱性氨基酸残基（11个精氨酸和4个赖氨酸），静电荷为+13，是一种较强的碱性多肽。其成熟肽有53个氨基酸残基，序列为：RRSKARGGSRGSKMGRKDSKGGSRGRPGSGSRPGGGSSIAGASRGDRGGTRNA。与已报道的代表性鱼类cathelicidins比对结果表明，鲑科cathelicidins普遍都存在一个或多个由六个氨基酸串联序列（RPGGGS）组成的遗传不稳定区域，这点与哺乳动物cathelicidins具有一定的相似性。其次，CATH_BRALE与其他鲑科cathelicidins都含有高比例的精氨酸和甘氨酸，后者使其与其他物种cathelicidins具有很大差异，可能与大分子相互作用有关。CATH_BRALE 在鱼鳃中有最高的表达量，其次是脾脏、肝脏，同源建模显示出的ɑ-helices和反相平行的β-sheets结构，这些均属于典型阳离子抗菌肽家族特征。化学合成的CATH_BRALE对检测的40余种菌株具有广谱的杀菌活性，尤其对革兰氏阴性菌，CATH_BRALE表现出比人cathelicidin—LL-37更强的活性。CATH_BRALE对铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）最为敏感，最小抑菌浓度仅为1.17μM，对鱼类的两种细菌性病原体杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌，最小抑菌浓度（MIC）低至9.38μM。CATH_BRALE对人的红细胞只有微小的溶血活性，溶血率仅为6.8%，显示出了很高的临床应用价值。