驴Cathelicidin EA-CATH1的结构与功能研究及分子设计

Cathelicidin由于在新抗生素开发、探讨免疫疾病发病机制、分子遗传机制等方面的重要性已成为国际研究热点。最近，我们从驴肺cDNA文库中成功克隆了两条编码cathelicidin的基因，其编码的成熟肽EA-CATH-1和EA-CATH2分别只有25和26个氨基酸残基，为首次在驴体内发现cathelicidin，国内外尚未有报道。与其他家族抗菌肽相比，EA-CATH1分子量很小只有3060，结构简单不含有二硫键，易于人工合成，实验表明具有广谱抗菌活性，对细菌、耐药菌、真菌等均具有极强的作用。.本项目希望通过深入研究EA-CATH1的溶液结构及其杀菌动力学，杀菌作用机制，通过结构修饰与改造，找出EA-CATH1的活性中心和关键的氨基酸位点，通过计算机辅助模拟，以EA-CATH1为模板，设计出大小与结构更加简单的小分子抗菌肽，为EA-CATH1及其衍生物的包括临床应用在内的实际应用打下基础

我们构建了驴肺脏cDNA文库；半巢式PCR的方法，从该cDNA文库中克隆得到两种新型Cathelicidins：Ea-CATH1和Ea-CATH2。它们分别由25（KRRGSVTTRYQFLMIHLLRPKKLFA）和26（KGRGSETTRYQFVPVHFFPWNKLSDF）个氨基酸残基组成，与目前已鉴定的其它物种内源性Cathelicidin抗微生物肽相比，没有序列同源性。它们均是碱性多肽，分别含有7个和4个碱性氨基酸残基。两者的分子量均很小，分别为3060.75 Da和3144.54 Da。.在所筛选的32株细菌和真菌中，化学合成的EA-CATH1小肽对大部分菌株均有很强的杀菌活性，尤其是临床分离的耐药性菌株；Ea-CATH1对其中革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度（MIC）大多在0.3-2.4µg/ml范围内。Ea-CATH1的抗菌活性在人血清中表现相当稳定，与血清在37℃孵育3天后，仍能发挥较强的抗菌能力；而且在高达20µg/ml的剂量下（远高于对应的MIC），Ea-CATH1对人血红细胞仅显示极微弱的溶血性（1.8%）。.圆二色谱显示，Ea-CATH1在模拟生物膜结构的50%TFE/ H2O溶液中主要呈现α-螺旋结构，但是在水溶液中主要采用无规则卷曲结构。在体外，0.6μg/ml的Ea-CATH1可以在2小时内彻底杀死106CFU/ml的金黄色葡萄球菌（ATCC2592），远胜于传统抗生素氨苄青霉素。利用扫描电子显微镜（SEM）观察经Ea-CATH1处理半小时的金黄色葡萄球菌（ATCC2592），结果证明Ea-CATH1能迅速破坏细菌的细胞壁和细胞膜，从而导致细胞裂解，细菌死亡；这或许是由杀菌动力学数据揭示的Ea-CATH1杀菌速度比传统抗生素快很多的原因。.在CaCl2存在的条件下，Ea-CATH1表现明显的红细胞凝集活性，说明它可能抑制细菌分泌的多聚蛋白与宿主红细胞表面相互作用，从而限制细菌的繁殖和传播。在PBS中，20μg/ml的Ea-CATH1表现较高的肥大细胞脱颗粒活性，说明它可能还是一种免疫效应分子，在宿主防御系统中介导重要的免疫反应。更重要的是，Ea-CATH1溶血活性非常低，且在血清中相当稳定；加之Ea-CATH1分子量小（3060.75Da），分子内和分子间均不含二硫键，易于人工合成，可以作为模版设计开发出一系列有实际应用价值的抗菌药物。