苓桂术甘汤通过FTO介导RNA甲基化m6A修饰调控NAFLD的作用机制研究

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is becoming most important chronic liver diseases. Traditional Chinese Medicine is a significant component of treating NAFLD. Previous work from our Lab suggested that a symptom termed "Spleen Yang Vacuity" represents a "turning point" during the pathologic progression of NAFLD. Our clinical studies have identified that Ling-Gui-Zhu-Gan Decoction significantly improved clinical effects of NAFLD patients with "Spleen Yang Vacuity". In addition , studies also found that Ling-Gui-Zhu-Gan Decoction can reduce dramatically hepatic lipid metabolism and FTO expression in HepG2 cell. The regulating mechanism may be related to m6A. Therefore, this project presents scientific hypothesis: Ling-Gui-Zhu-Gan Decoction regulates lipid metabolism in NAFLD through FTO/m6A. To confirm this hypothesis, using rat model of NAFLD induced diet or cell model of FTO knockout or overexpression, combining m6A sequence, it will confirm that LGZG can regulate FTO/m6A and C/EBPα, SREBP1c expression, to providing experimental evidence which Ling-Gui-Zhu-Gan Decoction cures NAFLD.

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为我国第一大慢性肝脏疾病。中医药是NAFLD综合治疗的重要组成部分。课题组前期通过临床流行病学调查提出了“脾阳虚是NAFLD慢性化复杂化拐点”新认识。在“病痰饮者，当以温药和之，苓桂术甘汤主之”治疗原则指导下，发现苓桂术甘汤可以显著提高NAFLD脾阳虚证患者的临床疗效。进一步研究发现，苓桂术甘汤显著降低NAFLD大鼠脂质代谢及HepG2细胞FTO表达，其作用机制可能与RNA甲基化m6A修饰有关。因此，本课题提出“苓桂术甘汤通过FTO/m6A调控NAFLD脂质代谢”科学假说。为验证该假说，本项目拟通过饮食诱导NAFLD大鼠模型，RNA甲基化测序观察m6A变化，并结合CRISPR Cas9技术敲除或过表达FTO，验证苓桂术甘汤对FTO/m6A及脂代谢基因C/EBPα、SREBP1c的调控，为经典方剂苓桂术甘汤治疗NAFLD的临床推广提供实验依据。

NAFLD已成为全球重要的公共健康问题。近年来研究显示，RNA甲基化m6A修饰及甲基化酶METTL3在脂肪酸氧化、胰岛素敏感性、肝脏炎症和脂肪变性方面发挥重要作用，可能是治疗NAFLD的切入点。课题组前期在病证结合、方证相应理论指导下，提出了“脾虚”是NAFLD之本(病病机)，“湿热”和“瘀血”是其常见表型(证病机)。而随着病情加重，患者脾阳虚表型逐渐显著。因此，课题组提出脾阳虚是NAFLD慢性化和复杂化'拐点'的病机。在《金匮要略》“病痰饮者，当以温药和之，苓桂术甘汤主之”传统理论指导下发现，本课题选用苓桂术甘汤治疗NAFLD。实验结果表明，苓桂术甘汤可以显著改善高脂饮食诱导的大鼠脂肪变性。此外苓桂术甘汤还可以显著降低RNA甲基化m6A的水平。M6A测序结果表明，苓桂术甘汤可以显著降低SOCS2的甲基化水平，进而降低SOCS2的表达，最终起到改善脂肪变性的作用。而在体外实验中，实验结果表明RNA甲基化酶METTL3的表达显著降低，而METTL3的沉默可以加重AML12细胞的脂肪变性。而桂皮醛可以显著促进METTL3的表达，改善AML12细胞和HepG2细胞的脂肪变性。转录组和代谢组学结果表明，METTL3的沉默可以降低CYP4F40的表达，并进一步降低花生四烯酸的水平，而桂皮醛可以促进CYP4F40的表达，进而促进花生四烯酸的水平。最后，桂皮醛改善脂肪变性的作用被METTL3的沉默所逆转。因此，本研究证实苓桂术甘汤通过m6A修饰调控SOCS2的表达，进而改善高脂饮食诱导的大鼠脂肪变性；而有效成分桂皮醛可以通过METTL3-CYP4F40介导花生四烯酸代谢进而改善肝细胞的脂肪变性。