肌动蛋白交联蛋白α-actinin在子宫内膜容受态建立中的作用及调控机制

It is thought that most of implantation failures result from abnormal uterine receptivity. Our previous study found that α-actinin，an actin filament crosslinking protein，exhibited cyclic changes in endometrium and downregulated during “implantation window”，such changes may have relationship with endometrium receptivity. However, the exact expression pattern and molecular mechanism remains poorly understood. Based on these important findings, our project will keep to carry out the following work: Analysis expression pattern of α-actinin and phosphor-α-actinin during a intact cycle ;Analysis of upstream regulator of α-actinin genes using co-transfection and luciferase reporter assays；Analysis the function of α-actinin in endometrial cells using gene over-expression and interference; Prove the function of α-actinin in vivo by conditional knockout. Demonstration of these issues will clarify the role of α-actinin in adjustment of endometrium receptivity and provide new theoretical basis and intervention targets to improve endometrium receptivity in clinic.

子宫内膜容受性欠缺是造成胚胎着床失败的主要原因，我们前期的研究发现α-actinin，一种肌动蛋白交联蛋白，在子宫内膜存在周期性变化，种植窗期时其表达显著下降，这种变化很可能与子宫内膜容受态的建立相关。然而还未明确α-actinin在子宫内膜的精细时空表达规律，以及其在子宫内膜容受态建立中的确切作用和调控机制。本课题拟首先通过免疫组化的方法明确α-actinin及其磷酸化活化状态在整个月经周期的表达模式;随后分析调控α-actinin基因表达的转录因子;再通过细胞株体外实验，明确α-actinin的过表达或siRNA干扰是否直接改变了子宫上皮细胞肌动蛋白纤维的聚合进而影响了细胞的粘附功能，同时，直接观察其过表达或siRNA干扰对滋养细胞与内膜上皮细胞结合能力的影响；最后，通过动物在体实验，观察子宫α-actinin条件敲除小鼠生育力的变化，验证α-actinin在子宫内膜容受态建立中的作用

子宫内膜容受性不足是成功妊娠的最大障碍之一。具备容受性的子宫内膜对于成功的胚胎着床和随后的胎盘形成是必不可少的。利用体外受精-胚胎移植技术的研究发现，大约三分之二的植入失败是由于子宫内膜的因素所致。在前期的研究中，我们已经发现α-肌动蛋白-1（ACTN1）的表达在着床窗口期显著降低，且其变化和子宫内膜容受性密切相关，然而，ACTN1在子宫内膜的具体功能及其在内膜容受性建立中的作用尚不清楚。在本项目研究中，我们通过使用RT-qPCR、western-blot和免疫荧光染色法，首先评估了健康育龄期女性月经周期不同阶段ACTN1的表达，随后对比了其在正常对照和反复着床失败（RIF）患者中的表达差异，结果显示，ACTN1在正常女性子宫内膜分泌中期的表达明显低于增生期，而RIF患者分泌中期子宫内膜ACTN1表达显著增强。随后，通过将ACTN1在Ishikawa细胞中过表达和基因敲除，分别进行了细胞功能的测定，结果显示，在功能上，ACTN1过表达增强了F-肌动蛋白纤维水平，促进了Ishikawa细胞的迁移，而ACTN1基因敲除则相反，但细胞的黏附功能变化不显著。通过使用RNA测序分析，我们将ACTN1过表达后的Ishikawa细胞进行了差异表达基因分析，基因分析（GO）和基因相互作用（KEGG）途径富集分析表明，这些差异表达基因主要集中在细胞外结构组织、细胞外基质组织、细胞外基质组分、MHC蛋白复合物等，蛋白质细胞外基质、整合素结合和细胞粘附分子结合中，在这些基因中，neblette（NEBL）是细胞骨架动力学和肌动蛋白丝稳定性的重要调节因子，在ACTN1过表达后，NEBL 在Ishikawa细胞中受到下调，更重要的是，与对照组相比，RIF患者的NEBL表达也显著降低。综上结果，本项目评估了ACTN1在人类子宫内膜中的作用，结果表明，上调的ACTN1损害了子宫内膜上皮细胞的正常迁移功能，很可能是通过调节NEBL/F肌动蛋白轴和随后的EEC细胞骨架改变，并可能最终影响子宫内膜容受性。这一结果将有助于我们进一步了解RIF的分子机制，并有助于开发新的治疗靶点。