铜转运蛋白调控对顺铂耳毒性的拮抗机制研究

Cisplatin is a potent chemotherapeutic agent commonly used in the treatment of variety neoplasms, but it is severely toxic to the inner ear. Currently there are no known cures or preventative treatments available for ototoxicity. Cisplatin-induced ototoxicity is initiated by its uptake into the sensory hair cells, neurons and supporting cells in the inner ear. Therefore, one of the most effective way to prevent cisplatin ototoxicity is the blockage of cisplatin into cochlear cells. However, so far, the pathways that regulate the uptake and translocation of cisplatin into tissue cells are not very clear. Our preliminary study has confirmed that cochlear cells expressed the high-affinity copper influx transporter CTR1 and copper efflux transporters ATP7A，ATP7B ; The absorption and discharge of cisplatin mainly depended on their activity in cochlear cells; Cation transporter inhibitor down-regulated three copper transporters in different degree, of which CTR1 down-regulation was of the most significant. In addition, it is reported that there is a low-affinity copper influx transporter CTR2, and the mechanism of cisplatin into cochlear cells via CTR1 and CTR2 may be different. Presumably, ototoxicity of cisplatin may be due to the functional imbalance of copper influx and efflux transporters, especially CTR1/CTR2 disfunction. To evaluate this hypothesis, this project intend to explore the mechanisms of the uptake and translocation of cisplatin by applying specific small interfering RNA and lentiviral-mediated gene transfection technology to bi-directionally regulate copper transporter protein expression, and then observe biological behaviors such as the changes of cochlear cells apoptosis and hearing in vitro and in vivo, thus providing the theoretical basis for the clinical development of effective drugs against cisplatin ototoxicity and new ideas for the antagonism of other heavy metals drug-induced ototoxicity.

本项目组的前期研究证实耳蜗细胞内存在着与铜及铂具有高亲和力的铜内流转运蛋白CTR1和铜外流转运蛋白ATP7A、ATP7B，耳蜗细胞对顺铂的吸收及排出主要依赖于它们在细胞内的活性，阳离子转运蛋白抑制剂可以不同程度下调三种铜转运蛋白的表达，其中以下调CTR1表达最为显著。此外，有报道机体细胞内还存在一种与铜和铂低亲和力的铜内流转运蛋白CTR2，它对顺铂转运的机制可能与CTR1不同。据此推测，顺铂耳毒性可能是由于耳蜗细胞内的铜内、外流转运蛋白功能失衡所致，尤其是与CTR1/CTR2的功能异常相关。鉴于此，本项目采用特异性小干扰RNA和慢病毒介导的基因转染技术双向调控铜转运蛋白表达，观察离体及在体耳蜗细胞凋亡、听力变化等生物学行为，从而探讨耳蜗细胞铜转运蛋白对铂转运的机制，为临床上研发有效的抗顺铂耳毒性药物奠定理论基础，也有望对其它重金属类药物所致耳毒性的拮抗提供新的思路。

顺铂具有不可逆的耳毒性，本研究用于探讨顺铂对耳蜗细胞、神经纤维的损伤机制，以及铜转运蛋白在顺铂耳毒性机制中的作用。本研究组发现离体耳蜗器官培养条件下，顺铂耳毒性并不是浓度依赖性的，低浓度顺铂对毛细胞和螺旋神经节具有明显损伤作用，这种损伤主要由细胞凋亡引起，而高浓度顺铂未见明显细胞损伤，这与自噬的激活有关，自噬的激活减缓了顺铂耳毒性，从而对毛细胞和螺旋神经节起到保护作用，本研究为今后应用自噬激活剂或抑制剂来干预自噬，探讨耳蜗细胞自噬作用的信号通路及这些通路与细胞凋亡之间的交互关系奠定了实验基础。同时，研究组还发现安全浓度的转染增强剂聚凝胺（polybrene）可增强慢病毒转染至耳蜗支持细胞，但仍不能转染毛细胞，本研究结果可用于对耳蜗支持细胞进行携带表达分泌性因子目的基因的慢病毒载体的转染，通过目的基因表达分泌性因子到达毛细胞膜周围或耳蜗内淋巴，从而直接或间接作用于毛细胞发挥治疗作用，此研究为耳蜗毛细胞保护提供了新的思路和途径。此外，研究组还发现铜转运蛋白家族参与了顺铂进出细胞的过程，铜转运蛋白1（CTR1） 和铜转运蛋白2 （CTR2）均在耳蜗组织中表达，其中铜转运蛋白2仅在耳蜗毛细胞和血管纹边缘细胞胞浆内表达，且这种表达在细胞内有一定极性分布的特点，即靠近细胞顶端的胞浆内，这可能说明CTR2蛋白功能很活跃，在顺铂转运中起非常重要的作用，但CTR2 在顺铂转运过程中的作用（入胞或出胞）以及其在顺铂作用后表达水平的变化尚需进一步研究。在体实验方面，耳蜗圆窗龛给药是建立顺铂诱导C57小鼠感音神经性聋模型的有效途径，有造模方法简单，组织损伤小及造模周期短等优点，有助于耳蜗毛细胞损伤和保护机制的研究。