RNAi调控Ctr1和OCT2表达拮抗顺铂耳毒性及靶向治疗价值

As a very common chemotherapeutics, the ototoxicity of cisplatin aroused more attention for a long time. Data show many ionophorous proteinss such as Ctr1 and OCT2 be responsible for influx of cisplatin, and these ionophorous proteins exist in almost all mammalian cochlea tissues. Nonspecific down-regulate expression of Ctr1 and OCT2 can attenuate ototoxicity of cisplatin. Ctr1 and OCT2 were expressed by SLC31A1 and SLC22A2 gene independently, shut down genes above lead to cisplatin transmembrane transport interruption, and furthermore prevents cisplatin ototoxicity development. The strategy of "fight against the enemy on the frontier" should be great significant in theory and application than anti-oxidant and anti-opoptosis using before. To identify the role of Ctr1 and OCT2 in the process of transmembrane transport and mechanism of antagonism, we set up a research project to verify the value of Ctr1 and OCT2 as a therapeutic target points based on previous study, with the aim to explore new methods and documentation for cisplatin ototoxicity protection using RNAi in vivo.

课题组成员前期研究及文献资料显示：铂通过特定的通道蛋白Ctr1、OCT2等实现跨膜转运，这些蛋白在哺乳动物耳蜗组织广泛存在，非特异性阻断内流通道蛋白Ctr1 和OCT2可减弱顺铂耳毒性效应。Ctr1和OCT2由SLC31A1、SLC22A2基因编码，应用特定技术暂时"关闭"编码基因可阻断顺铂的跨膜转运进而预防耳毒性效应的"启动"，这种"御敌于国门之外"的策略应该比既往采取的抗氧化或抗凋亡保护更具实际应用价值。为明确Ctr1和OCT2在顺铂跨膜转运中的作用及拮抗机制，课题组在拟在前期研究基础上，以活体动物顺铂耳毒性模型为工具，应用RNAi手段特异性阻断Ctr1和OCT2表达，从分子、细胞、听功能多水平验证Ctr1和OCT2作为治疗靶点的价值，以小分子靶向药物阻断顺铂跨膜转运为着眼点探索内耳保护的新方法，为RNAi 策略预防顺铂内耳损害提供证据支持。

本研究首先通过大鼠BRL细胞株和耳蜗器官型培养验证了重组蛋白TAT-PTDR在体外的安全性、转染效率和沉默效率。结果表明：TAT-DRBD可有效携带siRNA进入内、外毛细胞，转染效率达100%且无耳毒性。TAT-DRBD在大鼠BRL细胞和耳蜗基底膜介导的靶向Slc31a1(CTR1)的RNAi可分别稳定下调目标基因表达63%和47%，虽然沉默效率较脂质体转染（90%）略低，但鉴于蛋白载体可降解无毒性的特点，生物安全性高，有潜在的科研及临床应用价值。. 在顺铂离体耳蜗损害模型，通过TAT-DRBD介导RNAi沉默Slc31a1基因以抑制Ctr1对顺铂的摄取，观察到对顺铂耳毒性有明显拮抗效应，耳蜗基底膜中段单位长度（100μm）毛细胞密度统计学上存在显著性差异（87% vs 50%,P<0.05）。此外，实验中尚发现单一高浓度TAT-DRBD在体外对顺铂耳蜗损害有强烈的保护效应：在耳蜗器官型培养顺铂耳损害模型中，当TAT-DRBD浓度达到800nM时，对10μM顺铂模型的毛细胞保护可达到100%，对50μM顺铂耳蜗损害模型的毛细胞保护超过90%，当顺铂浓度达到100nM时，TAT-DRBD干预组仍明显优于对照组（P<0.01）。. 获得了南美栗鼠全耳蜗基底膜长度、单位百分比长度（10%）毛细胞密度及变化趋势，以及短声和不同短纯音诱发的CAP阈值。证实了南美栗鼠卡铂耳蜗损伤的毛细胞损害程度及CAP阈移及振幅变化有良好的对应关系。验证了经圆窗膜转染，TAT-DRBD介导的靶向沉默Slc31a1基因对成年南美栗鼠卡铂耳蜗损害的保护效应。结果表明：以50mg/kg腹腔注射卡铂14天后，4kHz、8kHz短纯音诱发的CAP未发生明显阈移。全耳蜗基底膜铺片显示在耳蜗底回对内毛细胞损害有明显保护（P<0.01）。. 从干预细胞凋亡通路的角度，通过离体大鼠耳蜗器官培养体系，证实TAT-DRBD转染靶向TP53的siRNA进入毛细胞介导RNAi能够有效拮抗顺铂耳蜗损害，顺铂浓度为10μM时，100nM及200nM TP53-siRNA保护几乎都达到100%（P<0.01）。. 为提高内耳病理数据的分析效率，方便本课题及后续研究对实验中获得的耳蜗形态学数据进行更全面分析，开发了“全耳蜗毛细胞定量分析系统”软件。.