构建基于人工橡胶粒子的离体天然橡胶合成体系

Rubber particles are organelles responsible for synthesizing and storing natural rubber, and are one of the ingredients that must be added to the traditional in vitro natural-rubber-synthesis system. Rubber particles isolated from the rubber latex of the Hevea brasiliensis still contain enzymes involved in natural rubber biosynthesis after washing, so the conventional in vitro natural-rubber-synthesis system has a high background. Recently, the attempt to establish artificial rubber particles using phospholipids and low-molecular-weight poly(cis-1,4)isoprene was successful. The establishment of a new natural-rubber-synthesis system based on artificial rubber particles will eliminate background reactions and clearly reflect the role of newly added ingredients. This study will introduce two cis-1,4-polyisoprene transferases (CPTs, which we identified earlier from H. brasiliensis rubber particles, and of which amino acid sequences are different from those of HRT1 and HRT2), separately, along with Nogo-B receptor, rubber elongation factor (REF) and/or small rubber particle protein (SRPP) into artificial rubber particles with the wheat germ cell-free protein expression system, trying to establish a new natural-rubber-synthesis system with controlled composition and low CPT background interference. This study will reveal the basic ingredients needed for the synthesis of natural rubber and, more specifically, the composition of rubber transferase complex, and will be helpful for the selection and improvement of rubber-producing plants such as H. brasiliensis.

橡胶粒子是合成与储存天然橡胶的细胞器，是传统的离体天然橡胶合成体系必需组分之一。从巴西橡胶树胶乳分离的橡胶粒子，经洗涤后仍包含天然橡胶合成酶类，使传统的离体天然橡胶合成体系具有较高的本底反应。最近，采用磷脂和低分子量橡胶烃构建人工橡胶粒子获得成功。建立以人工橡胶粒子为主要成分的新的离体天然橡胶合成体系，有望消除本底反应，并反映新添加成分的作用。本项目拟采用小麦胚芽无细胞蛋白表达系统将我们前期从橡胶树橡胶粒子鉴定的两个顺-1,4-聚异戊二烯基转移酶(CPT，序列不同于已报道的HRT1和HRT2)分别与Nogo-B受体、橡胶延伸因子（REF）和/或小橡胶粒子蛋白（SRPP）等蛋白质导入人工橡胶粒子，试图建立新的、组分可控的、低CPT本底干扰的离体天然橡胶合成体系。本项目将揭示天然橡胶合成所需的最基本成分及橡胶转移酶复合体的构成，并为巴西橡胶树等产胶植物的品种选育和改良提供参考。

橡胶粒子是合成与储存天然橡胶的细胞器，是传统的离体天然橡胶合成体系必需组分之一。从巴西橡胶树胶乳分离的橡胶粒子，经洗涤后仍包含天然橡胶合成酶类，使传统的离体天然橡胶合成体系具有较高的本底反应。建立以成分清楚的人工橡胶粒子为主要成分的新的离体天然橡胶合成体系，可以消除本底反应，并反映新添加成分的作用。本项目的研究目的是将顺式异戊二烯转移酶（CPT）与Nogo-B受体（HRTBP）、橡胶延伸因子（REF）和/或小橡胶粒子蛋白（SRPP）等蛋白质导入人工橡胶粒子，试图建立组分可控的、低CPT本底干扰的离体天然橡胶合成体系。本项目成功从胶乳直接纯化REF和SRPP，成功通过原核无细胞体系和原核细胞表达CPT和HRTBP，并开展离体天然橡胶合成测试。成功获得目标蛋白为后续离体天然橡胶合成实验克服了关键障碍。另外，了解橡胶合成酶复合体的组成情况对成功实现离体天然橡胶合成非常重要：我们对橡胶粒子蛋白用CPT抗体和HRTBP抗体进行了免疫共沉淀实验，发现一个含DUF1262结构域的未知功能蛋白,其基因能响应逆境胁迫上调表达；对历年累积的橡胶粒子蛋白样本进行了质谱鉴定，发现一个高频率出现的小肽，与其它蛋白共纯化，推测其是天然橡胶合成的必需组分。对作为参照体系的高山榕橡胶粒子和胶乳进行了蛋白质组研究，发现其胶乳中存在一些药用成分合成相关的蛋白。本项目纯化橡胶生物合成关键蛋白和鉴定橡胶转移酶复合体新的可能组分，为阐明天然橡胶合成机理及橡胶转移酶复合体的确切组成这一重大理论问题奠定了坚实基础。