补肾方介导C-myc－Bim-1－p16INK4a/Rb信号传导通路调控椎间盘衰老机制研究

椎间盘衰老与退变引起相关疾病是临床常见疾病，已成为学术界关注的焦点。.根据《内经o素问》"肾主骨，生髓"、"肾，其充在骨"等中医藏象理论，以D-半乳糖诱导SD大鼠衰老模型、SD大鼠椎间盘原代脊索细胞和大鼠C518软骨细胞株为基础，采用细胞培养和分子生物学等方法，研究补肾中药仙灵脾、补骨脂、女贞子、炙首乌中和他们有效组分淫羊藿苷、补骨脂素、齐墩果酸和首乌醇介导C-myc－Bim-1－p16INK4a/Rb信号转导调控椎间盘衰老的机制，进一步奠定补肾中药治疗脊柱退变性疾病基础，以深入探讨"肾主骨"理论的现代生物学机制，揭示"肾主骨"理论的内在规律，建立"肾主骨"理论的现代生物学研究的思路和方法学平台，丰富和发展中医"肾主骨"理论的科学内涵。

椎间盘源性疾病危害人类健康，其根本病理变化是椎间盘发生了级联性的加速退变，与正常椎间盘的衰老过程不同，退变的椎间盘细胞代谢紊乱、内外信号失调、基质丢失是一种典型的衰老性疾病。细胞的生命处于周而复始不断更新中，每一个周期都受到细胞周期信号传导通路的严密调控，其中由p16INK4a/pRb途径是控制细胞周期的关键信号传导途径，当该途径受到退变信号影响时，椎间盘细胞自我更新能力下降从而加速衰老。中医“肾主骨”理论是指导中医药延缓椎间盘退变性的基础理论，其延缓退变的机制之一可能与调控p16INK4a/pRb信号途径相关。本项目主要研究内容：（1）体内D半乳糖诱导的椎间盘衰老模型和补肾方干预C-myc/Bim-1/p16INK4a/Rb 信号传导通路的研究： 6月龄SD大鼠100只分为五组：正常对照组，D半诱导衰老模型组，补肾方干预组，维生素E干预组和老年组。病理形态学评分证明D半乳糖诱导可以加速椎间盘退变，细胞增殖下降凋亡率增加，并伴有软骨基质退变。维生素E和补肾方干预后，与模型组比较，补肾方组有延缓椎间盘退变的作用，形态学评分和细胞增殖凋亡等指标有明显的改善。免疫组化和PCR证实补肾方降低p16INK4a和升高RB基因的mRNA表达。（2）体外椎间盘细胞衰老模型的建立及补肾方中药单体干预C-myc/Bim-1/p16INK4a/Rb 信号传导通路的研究：建立了大鼠原代椎间盘髓核细胞培养和诱导衰老模型，通过CD24阳性染色鉴定可以区分软骨终板原代细胞；补肾中药单体可以增加D半乳糖诱导的椎间盘细胞SOD活性，降低ROS活性，从而延缓细胞凋亡。PCR证实补肾中药单体通过上调Cyclin D1和下调P16 INK4a基因 mRNA的表达，从而促进细胞增殖来抵抗D半乳糖诱导的衰老。（3）建立小鼠椎间盘3D组织培养和诱导衰老模型体外及中药单体干预C-myc/Bim-1/p16INK4a/Rb 信号传导通路的研究。建立小鼠椎间盘3D组织培养和诱导衰老模型体外，与普通平面培养相比模拟体内环境，减少细胞迁出，方便器官层面用药干预；细胞周期 PCR Array的检测结果发现：D半乳糖上调核转录因子E2F1的表达7倍左右抑制细胞周期，正常组和中药单体组CKS2基因表达比D半诱导组明显高7倍和和11倍，中药单体可以上调D半乳糖诱导的细胞周期蛋白依赖的激酶CDK7和CDK8升高表达5倍以上。