含神经营养因子的人工神经移植物的构建及其控释体系的研究

人工神经移植物桥接是临床上治疗周围神经缺损的有效措施，单独采用由材料构建的移植物修复长距离或粗大的神经缺损时，效果较差。已有的研究表明神经缺损修复中需要生物微环境如神经营养因子等物质的支持，这提示我们如果人工神经移植物上含有一定浓度的神经营养因子，将能够提高此类缺损神经的修复效果。本研究拟采用新型生物交联剂京尼平将NGF和NT-3交联在我们已研制成功的丝素蛋白和壳聚糖人工神经移植物上，研究交联条件对神经营养因子固定化率的影响，确定最佳的固定化工艺方法；考察固定化神经生长因子的性能及保存条件；在体外及大鼠体内进行NGF和NT-3释放规律的研究，用零级、一级及Higuchi方程进行释放模型拟合，从而系统定量地确定含神经营养因子的人工神经移植物释放因子的释放模式和速率；筛选出NGF和NT-3呈一定的浓度梯度且协同调控周围神经再生的量效关系。这些工作将为长距离或粗大的神经缺损修复提供更有效方法。

在本研究中，我们使用一种天然低毒的生物交联剂京尼平（genipin）将神经生长因子（NGF）交联到壳聚糖神经导管上，使神经生长因子能够缓慢释放，起来促进神经再生的作用。以NGF的固定化效率为指标，利用正交实验设计进行实验，考察壳聚糖、genipin、NGF三者之间的反应次序、摩尔比、导管的厚度、固定化温度、固定化时间等工艺条件对神经营养因子固定化的影响，从而确定壳聚糖导管固定NGF的最优化条件。经过交联度测试、溶胀度和溶胶分数测试、LDH细胞毒性测试，我们确定制备京尼平固定NGF壳聚糖神经导管的制备条件，京尼平终浓度为4mM，。通过ELISA法，我们测试了京尼平固定NGF壳聚糖神经导管缓释NGF的情况。结果表明，本实验制备的人工神经导管可缓释NGF超过60天以上，在第1至5天，平均每天有36ng的NGF释放。第6至30天，平均每天有12ng NGF释放。31天至60天，每日释放量平均是4ng。MTT测试表明，京尼平固定NGF壳聚糖神经导管浸出液培养的雪旺细胞活力与正常培养的相比无统计学差异。轴突生长分析测试和用细胞免疫组化测试结果表明从京尼平固定NGF壳聚糖神经导管上释放的NGF具有促进PC12细胞分化的生物活性。之后，我们将京尼平固定NGF壳聚糖神经导管用于修复SD大鼠10mm坐骨神经缺损。腓肠肌形态计量观察、电生理学检测表明，京尼平固定NGF壳聚糖神经导管可良好的修复大鼠10mm坐骨神经缺损，其修复效果与自体神经相当。因此，对于外周神经损伤修复，京尼平固定NGF壳聚糖神经导管具有良好的应用前景，相关核心技术已经申请中国发明专利和国际发明专利。在该项目资助下，发表SCI论文8篇，申请中国和国际发明专利各1项，培养博、硕士研究生8名。