蛋白激酶C在抗结核固有免疫中的作用及机制研究

Tuberculosis is a global problem that needs urgent attention. Macrophages recognize Mycobacterium tuberculosis (MTB) to induce nitric oxide production and inflammatory cytokines release, but the mechanisms are not fully understood. Mincle-Syk-mediated CARD9-NF-κB pathway plays a key role in antimycobacterial innate immunity. Recently, we found that MTB induced Syk-dependent Protein Kinase Cδ (PKCδ) phosphorylation in macrophages and that lack of PKCδ significantly reduced MTB induced TNF production by macrophages. These data suggest that PKCδ is involved in Mincle-Syk signaling and mediates innate responses to Mycobacterium tuberculosis. We will use in vitro assay to investigate the role of PKCδ in MTB induced nitric oxide production and inflammatory cytokines release by macrophages; we will study the role of PKCδ in Mincle-Syk-mediated signaling pathway; we will also use in vivo animal model to study PKCδ involvement in MTB induced inflammation. This will help us understand the fundamental mechanisms of host defense against Mycobacterium tuberculosis and facilitate the development of new antitubercular drugs.

肺结核是威胁人类健康的全球性公共卫生问题。巨噬细胞通过模式识别受体Mincle识别结核分枝杆菌（MTB）并释放一氧化氮和分泌炎症因子，但其确切机制尚未阐明。研究表明Mincle-Syk介导的CARD9-NF-κB信号通路与抗结核固有免疫关系密切。最近我们发现MTB可以诱导依赖于Syk的巨噬细胞蛋白激酶Cδ（PKCδ）的磷酸化；PKCδ的缺失显著减少MTB诱导巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子的水平，提示PKCδ将Mincle识别MTB所产生的信号传递给胞内信号通路并在抗结核固有免疫中发挥关键作用。本项目拟运用细胞生物学、分子生物学等手段研究PKCδ缺失对MTB诱导巨噬细胞释放一氧化氮和分泌炎症因子的影响；研究PKCδ在Mincle-Syk介导的信号通路中的作用；并在动物水平上研究PKCδ在MTB诱导炎症反应中的作用，揭示MTB与宿主免疫系统相互作用机制，为结核病的防治提供理论基础。

肺结核是致死率最高的感染性疾病之一。当结核分枝杆菌感染机体时，巨噬细胞通过其表面的模式识别受体识别结核分枝杆菌相应的病原相关分子模式，经过一系列的信号转导通路，促进一氧化氮（NO）释放和细胞因子分泌，直接杀伤或者激活适应性免疫应答清除病原菌。本项目首先利用PKCδ基因敲除的小鼠模型，体外分离培养骨髓源原代巨噬细胞。用TDM的体外合成物TDB刺激巨噬细胞，比较野生型与突变型小鼠巨噬细胞的IL-1β、IL-6等细胞因子以及NO产量在RNA和蛋白质水平的变化。实验结果显示，与野生型小鼠相比，PKCδ基因敲除小鼠的巨噬细胞在接受TDB刺激后，IL-1β，IL-6等细胞因子以及NO的产量都出现了显著下降；同样在PKCδ基因敲除的巨噬细胞中，上述蛋白编码基因在转录水平也出现了明显下降，提示PKCδ在MTB诱导巨噬细胞分泌炎症因子和释放一氧化氮过程中发挥重要作用。另外，我们还将TDM制备成乳剂，通过尾静脉注射入小鼠体内，观察小鼠肺部组织的变化，并测量肺部炎症因子的水平。体内实验发现，TDM注入小鼠体内后，野生型小鼠出现厌食、体重下降等现象，并有部分小鼠死亡。七天后剥离存活小鼠肺部发现其器官体积增大，并形成明显的肺炎肉芽肿。同时裂解其肺部组织，我们发现与突变型小鼠相比野生型小鼠肺部IL-1β，IL-6等炎症因子的分泌产量显著升高。相反，在实验过程中PKC δ基因敲除小鼠并未出现死亡现象，小鼠饮食和体重也未出现较大波动。剥离小鼠肺部发现其体积和形态正常，也未发现肺部肉芽肿的形成。这些结果提示PKCδ在MTB诱导的小鼠炎症反应中发挥重要的作用。最后，我们的实验结果还提示PKCδ可能参与MTB诱导和Mincle介导的NF-kB信号通路的活化。终上所述，本项目通过体外实验和小鼠模型，在分子、细胞和动物水平上证实PKCδ在抗结核固有免疫中发挥重要的作用，该研究结果揭示结核分枝杆菌与宿主免疫系统相互作用机制，对于探索机体抗结核分枝杆菌感染的具体分子机制具有重要意义，同时也可以为结核病的预防和免疫治疗提供理论依据。