Puma和Bim在慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡中的作用机制研究

Puma和Bim是重要的凋亡信号分子，p53/Puma和Myc/Bim分别代表p53依赖和非p53依赖凋亡通路。我们前期研究结果提示：Puma表达水平与慢性淋巴细胞白血病(CLL)预后密切相关，p53/Puma途径在CLL细胞凋亡中起重要作用。但CLL中Puma和Bim的具体作用机制和潜在治疗价值尚需进一步探讨，表观遗传学是否参与Puma表达调控仍未阐明。本研究拟体外沉默(或过表达)CLL细胞Puma和Bim基因，揭示他们在凋亡中作用机制和相对作用；分别和联合增加荷瘤鼠体内Puma和Bim表达水平，确定两者协同功能，探讨其潜在治疗价值；研究甲基化和miR-221/miR-222对Puma表达的调控机制；紧密结合临床，分析p53/Puma和Myc/Bim途径相关基因和蛋白表达与临床相关性。通过研究明确Puma和Bim在CLL细胞凋亡中的作用，为开拓相应的靶向治疗提供理论依据。

Bcl-2家族基因表达水平异常在慢性淋巴细胞白血病(CLL)发病中占据了重要的地位，而BH3-only亚家族基因是Bcl-2家族中一类重要基因。本研究选择BH3-only亚家族中具有代表性的Puma、Noxa、Bim基因，分析其与CLL患者不同临床和生物学特征关系，探讨BH3-only亚家族基因在CLL中的临床意义；使用氟达拉滨活性物质体外刺激CLL细胞，探索Puma、Noxa和Bim在p53依赖凋亡途径中作用及地位，及表观遗传学对Puma表达调控。结果发现：①CLL患者与健康人淋巴细胞Puma表达水平无显著差异(P=0.957)；Noxa(P<0.001)、Bim(P=0.041)及Bcl-2(P<0.001)表达水平明显高于健康人淋巴细胞的表达。②临床分期早患者Puma表达水平明显高于分期晚(P<0.001)；具有CD38 (P=0.002)和ZAP-70阳性(P=0.012)、LDH(P=0.009)和β2-MG水平增高患者(P=0.046)，其Puma表达水平均明显低于无以上因素患者；存在+12(P=0.003)、IgH基因易位(P=0.045)患者Puma表达水平明显低于无以上异常者。③与细胞分离时相比，经48h体外培养后对照组CLL细胞中Puma表达水平明显增加(P=0.0317)，但Noxa (P=0.5404)、Bim (P=0.3067)、Bcl-2 (P=0.1747)表达水平均未见明显变化。与对照组相比，经氟达拉滨刺激48h实验组CLL细胞中Puma表达水平明显升高(P=0.0359)，但Noxa (P=0.8063)、Bim (P=0.5703)、Bcl-2 (P=0.5322)表达水平未见显著性差异。④经氟达拉滨刺激后，p53功能正常细胞凋亡率明显高于p53异常细胞(P=0.0109)，且Puma在前者中的表达水平亦明显高于后者(P=0.0430)。⑤Puma mRNA表达水平与甲基无明显相关性，miR-221/miR-222对Puma有明显抑制效果。本研究认为Puma与CLL多种临床和生物学特征存在相关性，氟达拉滨诱导CLL细胞的凋亡有赖于正常功能的p53基因，其作用主要是通过诱导p53基因下游关键靶基因Puma表达增强实现，Noxa和Bim在氟达拉滨诱导CLL凋亡途径中并不起主导作用，miR-221/miR-222参与Puma表达调控。