基于人类全基因组编码蛋白高通量芯片筛选原发性胆汁性肝硬化血清特异性标志物的研究

PBC是一种临床常见的自身免疫病，研究表明中国人群PBC的发病率和死亡率都高于世界其它地区，危害更加严重。目前PBC已经成为我国肝脏疾病的重要组成部分，已引起临床高度关注。PBC发病机制不明，抗线粒体抗体在PBC诊断中具有重要价值，但其并非PBC特异性自身抗体，在干燥综合征等多种疾病均可出现，临床PBC早期诊断及鉴别诊断尤为重要。本研究拟采用人类全基因组蛋白表达高通量芯片，全面系统研究PBC血清自身抗体谱全貌。该芯片包含人类所有基因开放阅读框架表达蛋白（38400蛋白点）,我们前期研究结果显示，该方法在筛选自身免疫病生物标志物研究工作中，具有很多其他研究方法不可比拟的技术优势。通过多步筛选及多方法验证，期望发现与PBC早期诊断、鉴别诊断、临床表型、病程分期、预后和发病机制相关的特异性自身抗体。

本研究利用一种包含有16368 种非冗余人源重组蛋白质探针的高密度蛋白质芯片筛选原发性胆汁性肝硬化（PBC）疾病相关自身抗原。PBC 是一种发病机制不明的、慢性进展性胆汁淤积性肝脏疾病，其主要病理学特征是自身免疫介导的肝内中小胆管损害，进而导致肝纤维化、肝硬化、最终至肝衰竭。PBC 是一种自身免疫性肝脏疾病，自身抗体是PBC 正确诊断的有力工具。然而，这些自身抗体标志物对于PBC 的诊断并不尽如人意。因此，本课题研究的主要目的是利用蛋白质芯片技术筛选更多的PBC 自身抗原。首先通过少量PBC 血清与高密度蛋白质芯片杂交，数据分析结果显示23 种蛋白质为候选PBC 自身抗原。为了验证这一结果，重新表达其中的21 种蛋白质以及9 种临床上已经使用或最近报道的PBC 特异性自身抗原并将其用于制备PBC 自身抗原蛋白质芯片，然后采用191 份PBC 血清及321 份对照血清（43 份AIH 血清、55 份HBV 血清、31 份HCV 血清、48 份RA 血清、45 份SLE 血清、49 份SSc 血清及50 份健康人）与该芯片杂交筛选和鉴定PBC 自身抗原。分析结果显示13 种蛋白质探针在PBC 血清中有较高的敏感度（大于15%），其中6 个为新发现的自身抗原，它们是HK1 (isoforms I 和isoforms II), KLHL7,KLHL12, ZBTB2 和 EIF2C1。为了便于临床诊断检测，本研究建立了基于ELISA 技术检测抗KLHL12 和ZBTB2 自身抗体方法，取得了与芯片相似的结果。对297 份PBC 血清和637 份对照血清样本检测的结果发现敏感度分别为29.6%和11.2%，特异性分别为98%和99.7%。此外，在芯片检测中能明显区分PBC 血清与对照血清的抗HK1 和KLHL7 自身抗体也成功的应用于Westernblot 检测。总之，本研究联合采用高密度蛋白质芯片与一个较小的、但更具有针对性的PBC 自身抗原蛋白质芯片相结合的策略，可以有效地筛选和验证新发现的PBC 自身抗原，且部分可以有效的应用于ELISA 法的临床诊断检测。