clitocine通过cAMP/Epac/ERK通路逆转结肠癌化疗耐药的机制研究

clitocine, a natural compound with great anticancer activity, was purified from Leucopaxillus giganteus. Our published studies indicate that clitocine possesses significant sensitization effects on chemotherapeutics in human colon cancer cells by promoting Mcl-1 degradation. The pre-experiment for this project reveals that clitocine can suppress the expression of FBXW7 which is involved in Mcl-1 degradation. However, the underlying mechanism is still remaining to be further elucidated. Due to clitocine has an extremely similar structure as adenosine, the mRNA expression profiling was determined using NGS with the attentions especially on the cAMP metabolism and ERK pathway. Our pre-experiments also confirm that clitocine could indeed effectively inhibit the intracellular cAMP level and the activation of downsteam ERK signaling pathway. In fact, it has reported that ERK can suppress the FBXW7 expression by both promoting DNA methylation and protein degradation. Therefore, we hypothesis that clitocine, as a adenosine analogue, could downregulate the cAMP synthesis and its downstream ERK signaling pathway activation, promote the expression of FBXW7 and its induced Mcl-1degradation, and finally attenuate the drug resistance of human colon cancer cells. The underlying mechanisms for clitocine in chemo-sensitization effect will be determined in this study.

克力托辛是从野生大白桩菇中分离得到的抗肿瘤活性物质。课题组多项已发表的研究证实该化合物在人结肠癌中发挥显著的化疗增敏作用，且与促进Mcl-1蛋白的泛素化降解有关。本项目前期工作发现，克力托辛能够上调参与Mcl-1降解的泛素蛋白连接酶FBXW7的表达，但具体机制仍有待阐明。基于克力托辛与腺苷高度相似的结构特点，结合转录本测序分析结果，我们检测了克力托辛对细胞内cAMP水平和下游ERK信号通路的影响，结果显示两者都被明显抑制。据报道，ERK信号通路可通过DNA甲基化和蛋白稳定性两种途径调控FBXW7的表达，相关作用机制亦获得预实验部分证实。因此，我们推测克力托辛作为腺苷类似物，能够有效抑制细胞内cAMP的生物合成及其下游ERK信号通路的激活，促进FBXW7的表达及其介导的Mcl-1蛋白的泛素化降解，最后逆转了结肠癌细胞的化疗耐受性。本项目将详细阐明克力托辛发挥化疗增敏作用的分子机制。

化疗耐药是包括结肠癌在内的几乎所有恶性肿瘤的临床治疗面临的主要挑战。腺苷可通过与细胞表面受体结合，激活MAPK等信号通路调控肿瘤细胞的增殖、转移和耐药等，是重要的治疗靶点。Clitocine是从野生大白桩菇中分离提取到了一种高效的抗肿瘤活性物质。从结构上，clitocine与腺苷高度相似，前期预实验提示clitocine可能通过与腺苷竞争性结合A2B型受体，抑制了cAMP/ERK信号通路的激活，上调FBXW7的表达，促进Mcl-1蛋白降解，最后实现对肿瘤细胞的化疗增敏。.本项目从以下几个方面进一步阐明相关分子机制：.（1）利用A2B型腺苷受体抑制剂、基因敲除等手段，确定clitocine调控结肠癌细胞cAMP的生物合成是否依赖于A2B型腺苷受体，以及是否能够逆转clitocine对ABT-737的增敏作用。.（2）利用cAMP类似物Br-cAMP预处理，验证clitocine是否通过抑制cAMP的生物合成抑制下游相关信号通路的激活，并检测FBXW7的基因表达调控是否与基因启动子的甲基化有关，Mcl-1的表达调控是否依赖于FBXW7的泛素化。.（3）通过构建Mcl-1和FBXW7的过表达稳转细胞株，进一步确定clitocine在结肠癌中对ABT-737的增敏作用依赖于FBXW7介导的Mcl-1的泛素化降解。.（4）利用A2B型腺苷受体基因敲除SW620细胞进行裸鼠皮下移植瘤实验，联合clitocine和ABT-737处理，检测肿瘤的生长情况、肿瘤细胞凋亡、DNMT1、FBXW7和Mcl-1的表达情况，在动物水平确定clitocine通过A2B型腺苷受体调控FBXW7的表达及其介导的Mcl-1泛素化降解调控结肠癌的ABT-737耐药性。. 本课题实验结果显示，A2B受体的基因敲除不仅抑制了clitocine对cAMP的调控作用，也可在细胞、动物水平两个层面逆转clitocine对结肠癌的化疗耐药的增敏作用；Br-cAMP不仅有效抑制clitocine诱导的MAPK/ERK等通路的失活及其对结肠癌细胞的化疗增敏作用，还可以促进FBXW7的基因启动子的甲基化水平，抑制其介导的Mcl-1的泛素化降解。本项目研究成果进一步阐明了clticoine增敏结肠癌化疗耐药的分子机制，为其药物开发提供了新的理论基础。