木薯质膜单糖转运蛋白基因在块根发育和糖卸载中的功能研究

Cassava is an important economic crop which is grown in tropical and subtropical areas. Cassava storage-tuber formation and starch accumulation are closely related with the unloading of photosynthetic products. The uptake of monosaccharides from the apoplastic space across the plasma membrane is mediated by monosaccharide transporters named as STPs (sugar transport proteins) in storage roots (sink). It leads to the increase of starch synthesis. However, these transport genes were poorly reported. A total of 20 STP genes were captured in a genome-wide survey of the cassava genome database. This study will carry out the isolation identification, and expression of these STP genes using the methods of molecular biotechnology. Their functional characterization will be determined by heterologous expression in the hexose transport-deficient yeast mutant EBY.VW4000. The candidate STP genes, which may play important roles in sugar accumulation during the tubers development, will be found out in combination with all the previous reports. In addition, the transformed cassavas with over-expression or knockout of STPs will be used to fully analyze the functions of these genes in cassava. It might be helpful to understand the formation and development of cassava storage roots, and clarify the mechanism of starch accumulation, and ultimately provide molecular basis for the variety improvement of cassava.

木薯是广泛种植于世界热带和亚热带地区的一种重要经济作物，其薯块形成和淀粉积累与光合产物的卸载密切相关。质膜单糖转运蛋白在库器官中参与质外体卸载途径，能将胞外单糖分子转运进入胞内从而增加库细胞合成淀粉的能力。然而对木薯质膜单糖转运蛋白基因及其功能的研究尚未报导。通过对已发表的木薯全基因组测序数据进行生物信息学分析，推测到木薯基因组中包含20个质膜单糖转运蛋白基因(STP)。本项目拟利用分子生物学和生物化学方法对这些重要的功能基因进行分离和表达分析，并在酵母突变体中异源表达验证其单糖转运能力，进而选择参与糖卸载的质膜单糖转运蛋白基因，通过构建STP超表达或敲除载体转入木薯，对转基因木薯进行单糖转运蛋白基因功能的全面研究，从而解析木薯块根发育和淀粉积累机制，最终为木薯品种改良提供分子依据。

木薯是一种重要的热带块根作物，其薯块形成和淀粉积累与光合产物从源到库的转运相关。质膜单糖转运蛋白（STPs）的主要功能是将由细胞壁酸性转化酶（CWINV）降解产生的单糖转运到细胞内。在STPs与CWINV共同作用下，完成单糖从源到库的分配和转运过程。开展木薯质膜单糖转运蛋白基因（MeSTPs）的相关研究，将为解析木薯块根发育和淀粉积累机制奠定基础。本项目主要研究内容和结果如下：（1）MeSTPs家族基因的克隆与表达模式分析：完成了16个MeSTPs的克隆；通过荧光定量PCR分析了MeSTPs的表达模式，在不同组织部位和发育时期，MeSTPs的表达表现出较大的时空特异性。在块根发育早期（植后60-90 d）所有MeSTPs家族成员呈现出较高表达量；MeSTP7、MeSTP17和MeSTP19为块根发育初期（45d）特异性表达基因。（2）MeSTPs糖转运功能验证：通过酵母单糖吸收突变体互补实验，证实了大多数MeSTPs对单糖有着广谱转运活性，其中MeSTP3和MeSTP16表现出对半乳糖特异性转运能力。（3）MeSTPs的亚细胞定位分析：建立了木薯叶片原生质体的制备和转化体系，并利用该体系确定了16个MeSTPs均定位于细胞质膜。（4）MeSTPs的生物学功能分析：建立了1种高效低背景克隆/表达载体（pXST载体）和1种基于种皮荧光快速鉴定转基因种子的载体（pOGT载体），利用这两个载体获得了MeSTPs的拟南芥超量表达株系；通过木薯遗传转化体系，获得了MeSTP17、MeSTP19及MeCWINV3的转基因木薯株系，发现超量表达MeCWINV3限制了糖从源到库的输出和分配，进而减少了木薯块根的产量。本项目阐明了定位于质膜的MeSTPs参与木薯单糖转运的生物学功能。研究结果将为解析木薯块根糖转运机理提供理论依据。