E3泛素连接酶FBXW7通过负向调控巨噬细胞M2极化抑制哮喘发病及其机制研究

Asthma is pathologically characterized by chronic airway inflammation. Polarization of macrophage plays an important role in Th1/Th2 immune imbalance resulting in asthma, but the precise mechanism remains unclear. In our preliminary study, we found that the expression of FBXW7 and the M2 polarization of macrophages were increased in asthmatic mice than those in normal mice. Moreover, we observed that the airway inflammation resulting from asthma were much severe and the M2 polarization of macrophage were significant increased in mice with myeloid-specific deficiency of FBXW7 (Lysm-Cre+FBXW7f/f) when compared to WT littermates. These results suggested that FBXW7 might play an inhibitory role in development of asthma, and the mechanism might be related with the negative regulation of M2 polarization of macrophages. Based on these, this project aims to study the role and mechanisms of FBXW7 in development of asthma by regulating the M2 polarization of macrophages in animal models, in vitro and in vivo experiments and clinical samples from asthma cases. It may provide new insights to explain the mechanisms of occurrence and development of asthma and potential targets of the therapy of asthma.

目前认为支气管哮喘是由于Th1/Th2免疫失衡所致的气道慢性炎症性疾病，巨噬细胞极化在哮喘发病中起着至关重要的作用，但其调控机制仍不清楚。本课题组的前期实验发现哮喘小鼠肺组织中巨噬细胞M2极化和FBXW7的表达较正常小鼠明显增加；同时发现FBXW7缺陷小鼠气道炎症明显增加，巨噬细胞M2极化显著增强。结果提示FBXW7对哮喘可能具有抑制作用，其机制可能与负向调控巨噬细胞M2极化有关。本项目拟进一步深入研究FBXW7如何通过调控巨噬细胞M2极化来影响哮喘的发病，探索其如何调控巨噬细胞M2极化的信号通路以及作用的靶蛋白以阐明其分子机制，并结合临床样本研究FBXW7与哮喘发病严重程度、疾病的不同时期及治疗敏感性的关系。通过上述研究，将为FBXW7在哮喘中的生物学功能提供新的认识，并为建立防治支气管哮喘的新方法提供新的候选靶分子。

哮喘是儿童常见的慢性炎症性疾病，目前认为细胞免疫和体液免疫之间平衡失调所致的Th2优势是哮喘发病的主要机制。近年来，固有免疫成分在哮喘中的作用被发现和关注。树突状细胞是已知的专业抗原提呈细胞，在哮喘发病中发挥重要作用。我们检测到哮喘患者外周血单个核细胞和小鼠哮喘造模后的肺组织和纵隔淋巴结中FBXW7的表达升高，这一结果与公共数据库中已发表的数据相符。而FBXW7特异性缺陷（CD11c-Cre+ FBXW7fl/fl mice）的小鼠哮喘模型后嗜酸性粒细胞的浸润更明显，肺组织病理改变和粘液分泌也更严重，提示FBXW7在哮喘发生发展中发挥重要的负调节功能。通过体外培养骨髓来源树突状细胞（BMDC）、骨髓来源巨噬细胞（BMDM）以及磁珠分选肺泡巨噬细胞（AM）并进行过继回输及哮喘造模，确定FBXW7基因缺陷主要通过树突状细胞来影响哮喘发病。功能学研究表明FBXW7特异性缺陷对树突状细胞的发育分化和成熟、凋亡、抗原吞噬能力和体外迁移能力等均没有影响，但是KO（CD11c-Cre+ FBXW7fl/fl mice）小鼠来源的BMDC细胞因子的产生受到影响，并高表达CCL22等趋化因子。CCL22是募集Th2细胞的重要趋化因子，因此，FBXW7特异性缺陷的小鼠中更多的Th2细胞被招募，并产生更多的2型细胞因子，这解释了KO小鼠更严重的哮喘表型。进一步机制研究提示CCL22的转录因子PU.1可能是FBXW7调控DC的重要作用靶点。我们通过内源性免疫共沉淀实验，检测到BMDC中FBXW7能和PU.1相互结合并作用。已有文献表明FBXW7能特异性识别并结合底物，催化底物的泛素化和蛋白降解，从而影响其在胞内的稳定性。因此，我们利用CHX和MG132进行验证。结果显示，FBXW7主要影响了PU.1通过蛋白酶体途径的降解而不是其从头合成。这些结果表明在树突状细胞中，FBXW7能够结合并介导PU.1通过蛋白酶体的降解，下调其稳定性，从而影响其下游CCL22等趋化因子的产生。我们的研究探索了E3泛素连接酶FBXW7通过结合并降解PU.1，减少其下游CCL22等趋化因子的产生从而抑制哮喘的科学问题。研究结果为阐释哮喘的发病机制提供了新的观点和视角，并为寻找防治哮喘的新靶点提供新思路与新途径。