剪接microRNA的产生机制及其在胚胎干细胞向心肌细胞定向分化中的功能

The potency of embryonic stem cell in proliferation and directed differentiation to cardiac make the myocardial replacement therapy cure the disease with myocardial damage possible. Clarify the regulatory mechanism of embryonic stem cells differentiate into cardiomyocytes has important implications for the maturation and clinical application of cell replacement therapy. In our previous study, deep sequencing of small RNA was applied in the differentiation process of embryonic stem cells to cardiomyocytes, and the data was Comparative analyzed by bioinformatics software, which was published on Nucleic Acids Research in 2012. We also found some new classed of microRNA including intron splicing modified microRNA（ismiRNA），and GO enrichment analysis showed that their potential targeted-genes were clustered in the pathway of cardiac differentiation. Therefore, we would analyse the data from deeep sequencing by bioinformatics, establish RNA information library, and construct stable expression system for ismiRNA. The results will help to elucidate the mechanism of microRNAs in directive differentiation and provide new idea to find the targets that control the differentiation of stem cells and for clinical treatment of the related diseases.

胚胎干细胞的无限增殖和心肌分化潜能使细胞替代疗法治愈心肌损伤成为可能。阐明胚胎干细胞向心肌细胞分化的调控机制对于其临床应用具有重要的意义。我们前期通过生物信息学软件比较分析了胚胎干细胞分化为心肌细胞的深度测序数据，相关结果发表在2012年的Nucleic Acids Res上。同时发现许多未知的小RNA序列，包括可能通过内含子剪接修饰的miRNA(剪接miRNA)，对靶基因的预测及GO富集分析显示很多聚集在心肌分化相关的通路上。因此我们拟通过生物信息学方法对深度测序的结果进行序列分析，建立胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的小RNA信息文库，并针对剪接miRNA建立稳定的体外表达体系，为深入研究胚胎干细胞向心肌细胞分化中miRNA的作用及机制提供依据，有助于阐明miRNA在干细胞定向分化中的机制，为有效控制干细胞定向分化寻找新的靶点,进而为治疗相关疾病提供新的思路。

随着下一代测序技术(NGS)的发展，从一个样品中，会产生数以百万计的微小RNA片段。这些新技术，使得我们能够比以往更详尽地研究小RNA（sRNAs）。先前，通过克隆的方法和标准测序技术来识别新的sRNA。现在，下一代测序技术更有希望运用到对于微小分子RNA的发现，尤其对于那些在低丰度难以检测到的sRNAs。通常，测序得到的序列先比对到基因组上。尽管如此，仍有相当比例的序列不能比对到基因组上，因此它们被过滤掉。有趣的是，在这些被过滤掉的数据中，有不连续< 200nt的小RNA，它们是被基因组中的内含子打断。.因此，我们推测，有可能存在内源性含有内含子的miRNA（einc-miRNA）。成熟的inc-RNAs可以通过人工插入内含子RNA生成。在我们的工作，利用了一个分步走的策略：首先，在哺乳动物细胞中，潜在存在的inc-miRs由插入的内含子验证；然后，内源性的RNA由逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）证实。我们也实验证实，einc-miRs的普遍来自宿主基因。这些小einc-miRs的长度是9-29nt，并且精确地定位于外显子-外显子边界，具有发夹状前体，它们有特殊富含G的模序，并且含有较高的GC含量。有趣的是，它们中的一些如miRNA有3'端的修饰。.我们进一步证实这些einc-miRs在小鼠的胚胎干细胞分化成心肌细胞中呈动态表达形式，这正如同，它们在不同的小鼠组织中也有如此的表达形式。12个einc-RNAs的在心肌分化中都有所表达。一方面，生物信息学分析表明，这些einc-miRs是真正的产物。我们知道，宿主RNA随机降解产物会有很多种，因此，einc-miRs不是从核糖体RNA随机降解产物。另一方面，实验证据表明，这些RNA不是来自PCR操作。证明这些产物不是宿主RNA的降解产物。.我们的结果验证存在内源性的einc-miRs，它们在心肌分化过程中呈现动态表达。这里，我们提出了一个新的einc-miRs基因模型。einc-miRs不能轻易的下一代测序在测序中被检测到，是由于它们插入了基因组中的内含子。在一个转录区域，由于内含子的剪接，才得以生成编码RNA。准确地说，einc-miRs位于两个外显子交界处。通过这项工作，我们提出了一种策略来过滤深度测序中RNA和基因组的片段。希望能进一步启迪研究者，在目前没匹配上的测序数据中检测出更多的miRNAs。