斑马鱼一个脑积水突变体的鉴定与突变基因的功能研究

胚胎发育是一个复杂的过程，通过筛选影响胚胎发育的突变体并对其突变基因进行研究是阐明胚胎发育过程的重要手段。本项目以斑马鱼为模式生物，利用Tol2转座子介导的基因诱捕技术进行大规模的突变体筛选，并对获得的脑积水突变体进行表型分析；克隆了突变体中被突变的基因为add1，通过在斑马鱼胚胎中过量表达或反义寡核苷酸抑制等技术，探索该基因在室管膜纤毛的装配和正确发挥功能中的作用；阐明纤毛功能紊乱对CSF的形成、吸收和循环过程的影响，并阐明add1所参与的PKC等信号通路活性的变化，及add1的作用网络。通过本项目的开展，可望加深对脊椎动物胚胎早期发育调控的认识，对脑积水形成的分子机制做一个全新的解释，并为脑积水的诊断、预防及治疗提供一定的理论依据。

本研究利用Tol2转座子介导的基因诱捕技术进行了斑马鱼突变体的筛选，本次筛选获得了一个编号为YT-101的突变体，其纯合体在20 hpf时表现出头部发黑、卵黄延伸物萎缩，随着发育的进行，出现了后脑积水、头部和眼睛变小、全身的色素减少、血液循环减弱、血细胞减少、心包肿大等表型，到5 dpf时全部死亡。利用5’-RACE技术克隆到该突变体中的被捕获的基因为adducin 1，且证明YT-101的突变表型是由add1位点突变导致的。. 该突变体的表型广泛，本研究主要集中在其贫血表型上。对YT-101的造血过程进行检测，原位杂交结果证明初级造血过程的关键转录因子scl，draculin，gata2，和红细胞的标记基因、-globin在血液循环之前并没有明显变化，但是gata1细胞数量有减少。在血液循环开始后、-globin的表达急剧下降，说明突变体中初级造血过程能够正常起始、特化，但是血细胞不能正常存活。同时发现代表次级造血的关键基因runx1、c-myb在突变体中的表达减少，说明add1干扰了斑马鱼的次级造血。电镜切片观察48 hpf中幸存的血细胞仍然以红细胞前体细胞的形式存在，表明突变体中红细胞的分化成熟过程受到影响。.pH3的免疫荧光结果显示突变体中的细胞增殖受到抑制，同时TUNEL分析证明突变体中发生了广泛的细胞凋亡，且gata1+细胞从14体节就能够检测到细胞凋亡，就是说细胞增殖的抑制和细胞凋亡的发生共同导致突变体中血细胞数量减少。同时发现p53, bbc3, mdm2 , fst等细胞凋亡调控基因的表达被上调。.本研究表明，利用Tol2转座子介导的基因诱捕技术可以获得影响斑马鱼发育的突变体，add1的缺失激活了一些细胞凋亡信号通路，抑制了细胞增殖，这可能是导致YT-101出现贫血表型的原因。