肿瘤特异性PEG-3启动子控制的报告基因MR成像活体监测干细胞瘤变

Teratoma formation seriously devalues the stem cell-based therapy strategy. Noninvasive imaging of the stem cell-derived teratomas is a top priority of stem cell research. To date, there have been no methods that could detect teratomas with specificity and at the cellular or molecular level. Studies have shown the PEG-3 is a gene expressing specifically in tumors. Using the promoter of the PEG-3 to drive a reporter gene expression specifically in the tumor cells could realize early detection of stem cell-derived teratoma formation. In this study, we will establish the iPSC/PEGp-FTH1 cells by transfecting the induced pluripotent stem cells with the reporter FTH1 driven by PEG-3 promoter. After cells transplantation, MRI was dynamically performed to monitor the teratoma formation. It is expected that the PEG-3 promoter activates and triggers FTH1 expression while the stem cells derive into tumor, then lead to iron accumulation and MRI signal change. The aim is to realize the “turn on or off” of the reporter gene (silence in stem cells but express in tumor cells), and ultimately provide a sensitive and specific noninvasive imaging modality for monitoring teratoma formation after stem cells transplantation.

畸胎瘤的形成是多能干细胞治疗策略的主要缺陷。利用活体成像方法对移植后的干细胞进行动态监测并及时发现瘤变，是干细胞临床应用的必要前提。目前尚未有一种成像方法能够在细胞或分子水平特异性检出干细胞瘤变。PEG-3是一种广谱的肿瘤特异性基因，我们前期研究证实PEG-3启动子在畸胎瘤细胞内高表达，而在干细胞及其分化的正常细胞内表达极低，利用该启动子驱动报告基因在肿瘤细胞内特异性表达，有可能实现对干细胞瘤变的早期检测。本研究拟构建PEG-3启动子控制报告基因铁蛋白（FTH1）表达的诱导性多能干细胞（iPSC/PEGp-FTH1），并移植于裸鼠皮下，在畸胎瘤生成过程中行动态MR成像及相关组织病理学检测。期望通过干细胞瘤变时PEG-3启动子的激活来驱动报告基因FTH1表达，从而实现报告基因的自动开关功能（在干细胞内沉默，而在瘤变时表达），最终为干细胞移植后畸胎瘤变提供一种敏感而特异的活体影像学监测手段。

现有证据表明间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可发生恶性转化，这是MSC治疗的严重局限性。因此，有必要通过一种非侵入性的成像方法来监测MSCs的恶性转化。尽管基于报告基因的磁共振成像(MRI)已成功应用于对MSCs的纵向监测，但该技术不能区分恶性转化前后的细胞。在此，我们研究了使用肿瘤特异性启动子驱动报告基因表达用于MRI检测MSCs恶性转化的可行性。对报告基因铁蛋白重链(FTH1)进行修饰，加入肿瘤特异性基因Peg3(Peg3)启动子，转染MSCs，获得MSCs-Peg3-FTH1。通过与C6胶质瘤细胞间接共培养，诱导细胞发生恶性转化，命名为MTMSCs-PEG3-FTH1。癌变前后分别进行FTH1蛋白印迹分析、普鲁士蓝染色和透射电镜(TEM)检测细胞内铁、MRI检测信号变化。然后将恶性转化前后的细胞接种于裸鼠皮下，行MRI检查，观察移植瘤内信号的变化。MTMSCs诱导恶性转化后，在形态、增殖、迁移、侵袭等方面表现出肿瘤样特征。MTMSCs-Peg3-FTH1的FTH1表达明显高于MSCs-Peg3-FTH1。普鲁士蓝染色和透射电镜显示MTMSCs-PEG3-FTH1中铁颗粒较多，MSCs-PEG3-FTH1中铁颗粒较少。MRI显示MTMS Cs-PEG3-FTH1的T2值明显低于MSCs-PEG3-FTH1。在体内，MTMSCs-PEG3-FTH1组可见肿块形成，而MSCs-PEG3-FTH1组未见肿块形成。T2加权MRI显示明显的信号降低，这与组织块中铁的积聚有关。综上所述，我们开发了一种新的基于报告基因的MRI监测系统，通过将基因报告基因FTH1改造为肿瘤特异性启动子Peg3的控制，来检测干细胞的恶性转化。对于成像系统，报告基因在干细胞中保持沉默，而它的表达是在干细胞发生恶性转化时由启动子触发的。这使得报告基因具有“开启”功能，并使MRI能够灵敏地检测干细胞致瘤性的发生。肿瘤特异性MRI监测系统可以通过尽早检测恶性转化的干细胞，甚至通过结合一些治疗基因消除转化的干细胞，潜在地增强基于干细胞的治疗策略的安全性。