可调控报告基因magA用于干细胞MRI活体示踪

magA基因表达可在细胞内产生大量纳米级磁小体，是一种可用于干细胞长期示踪的理想的MRI报告基因，而可诱导性慢病毒系统不仅能将目的基因稳定地转入干细胞，还能在转录水平定时、定量调控目的基因表达。本研究拟利用带有四环素调控标签的可诱导性慢病毒系统将magA基因转染到大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,构建能够调控magA基因表达的MSCs，并将转基因MSCs移植入大鼠脑纹状体，在不给予外源性对比剂的情况下，通过口服不同浓度的四环素来调控magA基因表达，于不同时间点行3 T MR成像，动态观测移植区信号变化，并与相关组织病理学对照，探讨magA报告基因用于干细胞MRI示踪的有效性和可控性，明确四环素调控magA基因表达产生磁小体及MRI信号变化的量效、时效关系，从而实现MRI报告基因的"开关"功能，为干细胞移植的活体示踪提供一种新型的、可调控的MRI报告基因成像技术。

利用MRI报告基因成像可实现对移植细胞的长期示踪，然而,报告基因的过度或持续表达，可能引起细胞损伤甚至机体铁代谢紊乱，这就需要对报告基因的表达时间和表达水平进行精确调控。四环素（tetracycline, Tet）基因表达调控系统可在基因转录水平定时、定量地调节基因表达，是在分子水平调控外源基因表达的有力工具。本研究将MRI报告基因成像与Tet-On系统相结合，将FTH1克隆入携带Tet-On标签的慢病毒，重组具有开关表达FTH1的慢病毒系统(LV-Tet-FTH1)，并分别感染干细胞（C3H10T1/2）和肿瘤细胞（SK-N-SH），成功构建能够调控FTH1基因表达的多种细胞系（C3H10T1/2- Tet-FTH1和SK-N-SH-Tet-FTH1），通过不同浓度及作用时间的四环素（Dox）来调控FTH1基因表达，研究四环素调控与FTH1基因表达的量效、时效关系。同时将SK-N-SH-Tet-FTH1细胞移植入裸鼠体内，不同浓度和作用时间的四环素条件下，MR成像动态观测其信号变化，并与相关组织病理学对照，探讨报告基因用于移植细胞MRI活体示踪的有效性和可控性。结果显示，FTH1蛋白诱导表达量与四环素浓度及时间呈明显依赖关系，在体外培养添加500ug/ml 枸橼酸铁（FAC）的条件下，0.2 ug/ml Dox作用72 h，FTH1的表达达峰值，R2值最高（p＜0.05）。体内给予5 mg/ml FAC条件下，2 mg/ml Dox作用5d后FTH1表达和MRI信号最明显。MRI信号与Dox作用时间关系：未加入Dox，双侧移植物信号无差别；加入Dox5d，SK-N-SH/Tet-on/FTH1移植物信号较对侧明显降低；撤走Dox，SK-N-SH/Tet-on/FTH1移植物信号回到最初水平。MRI信号与Dox浓度关系： Dox为2 mg/ml时，R2值明显升高（p＜0.05）；继续增加Dox浓度，R2值反而降低。普鲁士蓝染色和电镜均证实，Dox/FAC组移植细胞内大量铁颗粒，且其数量与Dox作用时间和浓度有关。本研究成功构建了携带可诱导性报告基因的干细胞和肿瘤细胞，证实了FTH1基因转铁作用的有效性和可控性，明确了体内外Tet-On调控报告基因表达的量效和时效关系，实现了报告基因成像的“开关”功能，最终为细胞移植提供了一种新型的、可调控的、无创的报告基因成像系统。