复杂生物体系中关键功能代谢物筛选的新方法、新技术研究

The main challenges of current functional metabolomics are the global-scale quantitative analysis of complex metabolome and screening of the key functional metabolites associated with a certain biological process. Metabolite-protein interactions have already been shown to be involved in the regulation of different types of cellular processes including signaling events, enzyme activities, protein localizations and interactions. A novel process for assigning metabolite-protein interactions will be developed to characterize protein-bound metabolites. To improve the specificity and throughput, novel protein immobilized materials will be synthesized. Global metabolomics techniques will be applied to characterize and identify the interactions between metabolites and proteins. To improve detection of low-abundance, polar and poorly ionized metabolites which are insoluble by conventional metabolomics method, high sensitive analytical methods will be developed. A series of novel materials for the enrichment of low-abundance metabolites, stable-isotope tagged derivatization reagents to label poorly retained and/or ionized polar carboxylic acids- and amino-containing metabolites will be carried out. The above method will be useful for discovery of important functional metabolites in complex biological samples and expanding the coverage of the metabolome analysis. Metabolic characterization of hepatocellular carcinoma cell will be carried out using the above novel methods and techniques. The principal metabolic alterations, the key functional metabolites and important metabolite-protein interactions will be found in HCC tumors. Implementation of the project will develop analytical tools for functional metabolomics. It is expected to benefit understanding of function and regulation of biomolecules.

对复杂生物体系的代谢组进行规模化定量分析，并从中筛选出与特定生物事件相关的关键功能代谢物是当前生命分析化学研究的重点和难点。本项目以代谢组学分析技术为核心，拟结合材料化学等技术，构建新型高通量、特异性、高灵敏度的代谢物-蛋白质互作和表征体系，以期实现关键功能代谢物的特异性、高通量筛选和表征。针对现有分析技术难以检测的低丰度、强极性、难离子化的代谢物，发展高灵敏的代谢组学新方法以及代谢物结构鉴定新技术，扩大对代谢组分析的覆盖率，提高重要代谢物发现的概率；将上述方法用于肝癌细胞的代谢特征研究，寻找与肝癌发生相关的关键代谢物、代谢物对蛋白质的调节作用及相关代谢通路变化，为干预肝癌的生长增殖和侵袭过程提供科学依据。本项目的开展，将为复杂生物样本的功能代谢组学研究提供分析技术手段。项目的实施能够提高我国在复杂生物样本分离分析的学术水平，为功能基因组学的发展提供有力的技术支撑。

当前代谢组学正从最初的表型识别逐渐发展到功能代谢组学研究。如何对数目浩瀚、化学性质各异的代谢物进行规模化定量分析，并从中发现与特定生物事件相关的关键功能代谢物是当前研究的热点和前沿，也是生命分析化学的难点，急需发展从复杂生物体系中筛选关键功能代谢物的方法。代谢物的功能大多通过与蛋白质的相互作用来实现，代谢物与蛋白质相互作用的研究被视为是了解代谢物对蛋白质功能调控机制的钥匙。本项目首先在代谢组学的高覆盖、高灵敏分析新技术、新方法方面，研制了纳米亲和材料与固相表面衍生化反应及轻/重同位素标记相结合的高灵敏度高选择性样品预处理新方法；研发了基于新型多维液相色谱-质谱技术的高覆盖代谢组学分析新方法，极大地拓展了单次分析对代谢组和脂质组的覆盖度和分离度。采用拟靶向技术和数据校正等关键手段解决了大规模代谢组学分析的技术瓶颈问题。发展了基于结构-质谱断裂/色谱保留规律、SWATH质谱采集模式及拟靶向脂质组学等高覆盖分析新方法。构建了代谢组学定性数据库，形成了完整的高覆盖高灵敏代谢组学分析平台。其次，在代谢物-蛋白质互作体系构建及在大规模发现功能代谢物中的应用方面，研制了新型蛋白固定化磁性纳米材料（CMPEIn-Ni2+@SiO2@Fe3O4）；构建了基于代谢组学和非变性质谱技术的规模化发现潜在功能代谢物的新方法并应用于内源性脂质代谢物-过氧化物酶体增殖物激活受体蛋白（PPAR）的互作体系；建立了基于动态体积排阻色谱方法的代谢物-蛋白质相互作用研究方法并用于筛选血清代谢物提取物中HSA的内源性配体。最后，将所发展的新方法与技术应用于大规模多中心临床样品的肝癌血清诊断型组合代谢标志物研究，鉴定和验证了二个新型的肝癌代谢标志物：甘氨酸胆酸、苯丙酰色氨酸。揭示了脯氨酸/羟基脯氨酸代谢途径在肝癌发生及靶向药物索拉非尼耐药机制中的作用。已发表SCI收录论文50篇，包括Nature Protocols，Hepatology，Clin Cancer Res，Anal. Chem.等。试剂盒临床批件1个，授权发明专利5件，软件著作权2件，申请发明专利7件，培养11名博士研究生。