松弛素3在鱼类精子发生过程中的作用及分子机制研究

Fish androgen (11-KT) and progestin hormone (17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one, DHP) were considered as the key hormones in spermatogenesis and sperm maturation. However, treatment by steroidogenic enzyme inhibitor of 11-KT, or mutation of DHP receptor gene had no effects on fertility of male fish. Intriguingly, we found that mutation of RLN3 resulted in failure of second meiotic division, absence of spermatids and infertility. Meanwhile, RLN3 gene deficiency led to the decrease of androgen and gonadotropin production. Therefore, fish spermatogenesis might be tightly controlled by RLN3 peptide hormone. In this proposal, the expression pattern of RLN3 and its receptor in testis and brain will be characterized. Knockout of RLN3a, RLN3b and their receptor and rescue by each RLN3 transgene, 11-KT, hCG will be carried out to further clarify the possible roles of RLN3 in fish spermatogenesis. To understand the epigenetic modification in RLN3-regulated spermatogenesis, lncRNA sequencing, DNA methylation modification of the key genes of reproductive axis will be examined between control and RLN3 knockout fish in the brain and testis. Finally, ChIP-seq will be carried out to clarify the possible target genes of RLN3, and Real-time PCR and in situ hybridization will be used to characterize the expression level of potential RLN3 target. The final goal of this project is to bring insights into the molecular and epigenetic mechanisms of RLN3 in spermatogenesis regulation in teleosts.

雄激素（11-KT）和孕激素（DHP）被认为是促进鱼类精子发生和成熟的关键因素，但雄激素合成酶抑制剂处理，或DHP受体基因突变未影响雄性育性。我们发现松弛素（Relaxin3，RLN3）缺失导致精子发生不能进入减数第二次分裂，不能形成精子细胞，雄性不育，促性腺激素和雄激素合成水平下降，表明RLN3可能是鱼类精子发生过程的关键调控因子。本项目拟鉴定RLN3及其受体在脑和精巢的表达模式，建立RLN3及其受体的敲除模型，分别用RLN3转基因、hCG、11-KT对基因敲除个体进行回救，深入研究RLN3对精子发生的影响。通过RNA-seq研究基因敲除对lncRNAs和生殖轴关键基因表达水平的影响，检测DNA甲基化修饰状态的变化。通过ChIP-seq筛选RLN3的靶基因，qPCR和原位杂交等检测靶基因的表达。本项目旨在揭示RLN3调控精子发生的分子机制和表观遗传机制。

本项目以尼罗罗非鱼（Orochromis niloticus）为实验动物，构建rln3a和3b基因的敲除模型，从HPG轴（脑-垂体-性腺）的不同层面，揭示了Rln3调控精子发生和雄性育性的分子机制。研究结果概述如下：.1、通过Real-time PCR对罗非鱼脑、垂体和性腺的检测发现，rln3a在精巢中高表达并特异性表达于精巢间质细胞，而rln3b在脑中高表达。双色荧光原位杂交显示，rln3a/3b及其受体均定位于中脑视顶盖的中央纤维层。脑分区Real-time PCR结果表明，rln3a和rln3b在罗非鱼间脑中的表达量最高，rln3的四个受体rxfp3、rxfp3.2a、rxfp3.3a3、rxfp3.3b在几个脑区和精巢中都有表达，因此推测rln3可能通过HPG轴调控尼罗罗非鱼性腺的发育。.2、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在尼罗罗非鱼中成功构建了rln3a基因的纯合突变系，研究发现，与对照雄鱼相比，rln3a-/-雄鱼的成熟精子数量减少、精子形态异常、精巢中生精细胞数量显著减少，生殖相关基因表达也显著降低，说明rln3a突变影响精子发生，导致雄性不育，后续育性实验也证明这一点。Rln3a-/- 突变导致雄激素合成酶基因显著下降，11-KT合成水平降低，而hRLN3（人RLN3重组蛋白）和11-KT能回救rln3a突变导致雄鱼育性的降低。进一步研究发现cAMP/PKA信号通路相关蛋白的表达显著下降，结合该通路的激动剂和抑制剂处理实验，证明了rln3a突变对精子发生的影响可能是通过cAMP/PKA信号通路实现的。.3、通过不同脑分区的转录组测序，发现rln3基因突变导致脑生物节律相关基因表达紊乱。多巴胺合成水平增加，但多巴胺受体表达水平显著下调，证明Rln3a缺失导致多巴胺信号通路阻滞，进而影响脑垂体FSH和LH的表达，最终影响雄性育性。.4、同时我们构建rln3b纯合突变系，rln3b基因突变导致雄鱼精小叶结构萎缩，精子发生过程受到抑制，类固醇合成通路相关基因的表达也显著降低，说明rln3b可能通过影响精巢体细胞环境调控精子发生过程。.5、在项目执行期间，项目负责人申请获准国家自然科学基金面上项目1项，重庆市自然科学基金面上项目1项，重庆市教委研究生科研创新项目1项；培养学生14人（博士2人，硕士12人）；发表SCI收录论文共6篇（均已标注）