Gal-3在维生素D调控蛋鸡OC形成和活化中的作用及机制

Although it has been confirmed that vitamin D can directly regulate osteoclastogenesis, bone resorptive activity and the expression of galectin 3 (gal-3), the role and mechanism of gal-3 in this process is still not very clear. It is well known that in cytoplasm gal-3 can control gene transcription in cell proliferation and differentiation after entering the nucleus with β-catenin. Here, we will study the role and mechanism of gal-3 in osteoclastogenesis of by vitamin D so as to learn about the mechanisms of calcium and phosphorus metabolism disorders in layers. OC will be induced from bone marrow derived macrophage (BMM) of chicken embryo or hens. Gal-3 expression and sub-cellular localization will be detected after vitamin D treatment. To confirm the role and β-catenin mechanism of gal-3 in this process, the investigation of osteoclast formation, activation and the changes of β-catenin signaling pathway will be carried out, after treatment by vitamin D on the bases of gal-3 overexpression or gene silencing. Finally, key target genes of gal-3 will be found and verified to confirm the gene mechanism of gal-3 in the regulation of osteoclastogenesis controlled by vitamin D.

申请者已证实维生素D能够直接调控破骨细胞（OC）形成和活化，该过程涉及gal-3的变化，但gal-3在维生素D调控OC形成和活化中的作用及机制仍不清楚。由于胞浆gal-3能够与β-catenin结合进入细胞核，调控基因转录。因此，本项目拟在诱导蛋鸡骨髓源性单核巨噬细胞（BMM）形成OC基础上，研究维生素D对gal-3表达的影响；进一步过（低）表达gal-3，探究gal-3在维生素D调控蛋鸡OC形成和活化中的作用及β-catenin信号机制；最后通过基因芯片技术寻找gal-3在维生素D调控蛋鸡OC形成和活化中的关键靶基因，选择部分重要靶基因进行验证，揭示gal-3在维生素D调控蛋鸡OC形成和活化中的作用及机制，为蛋鸡钙磷代谢紊乱性疾病的防治提供理论依据。

1α,25-(OH)2D3能够促进骨髓基质细胞（BMSCs）表达破骨细胞分化因子（RANKL），间接诱导破骨细胞（OC）的形成，也可在RANKL和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的基础上直接调控骨髓单核巨噬细胞（BMM）分化为OC，该过程涉及半乳糖凝集素3（gal-3）的变化，但gal-3在其调控OC形成和活化中的作用及机制仍不清楚。因此，本项目探究了gal-3在维生素D调控OC形成和活化中的作用及β-catenin信号机制，寻找了部分关键靶基因。结果显示，（1）鸡BMSCs与BMM共培养可以生成OC，10-10 ~10-8 mol/L的1α,25-(OH)2D3能够促进BMSCs中rankl mRNA的表达和蛋白分泌，间接促进OC形成。（2）1α,25-(OH)2D3能够促进鸡OC及BMSCs中gal-3 mRNA的表达及蛋白分泌，BMSCs中gal-3表达的改变更明显。（3）敲低鸡BMSCs中gal-3抑制OC分化和骨吸收活性，减弱1α,25-(OH)2D3促进OC分化和骨吸收效应；过表达鸡BMSCs中gal-3促进OC分化和骨吸收活性。（4）干扰鸡BMSCs中gal-3的表达后307个基因上调，253个基因下调。过表达gal-3后显著上调及下调的基因为214个及418个。差异基因KEGG分析发现，细胞因子受体相关通路、Ca2+信号通路和Wnt信号通路显著富集。qRT-PCR证实一氧化氮合酶（NOS2）、缓激肽B2受体（BDKRB2）、内皮素B受体（EDNRB）、BMP活化蛋白膜结合抑制剂（BAMBI）、DKK1和Wnt抑制因子（WIF1）基因与测序结果趋势一致。此外在小鼠OC研究中还发现，（1）RANKL与M-CSF联合使用能够促进小鼠BMM形成OC，10-8 mol/L的1α,25-(OH)2D3对小鼠OC的形成具有抑制作用。（2）1α,25-(OH)2D3促进小鼠OC中gal-3和β-catenin mRNA的表达及蛋白分泌。（3）小鼠OC前体中β-catenin敲减不影响1α,25-(OH)2D3对OC形成的抑制作用，gal-3敲减可促进OC形成，减弱1α,25-(OH)2D3对OC分化的抑制作用。说明，gal-3在1α,25-(OH)2D3调控OC的形成和活化中发挥关键作用，靶向基因主要涉及细胞因子受体相关通路、Ca2+信号通路和Wnt信号通路。