维生素D调控破骨细胞形成及活化的差异蛋白组学研究

Although there were many research about the mechanisms of vitamin D on the metabolic bone disease, but the direct effects of vitamin D on osteoclasts' formation and activation is not very clear. Fortunately, proteomics as a new discipline, has great value in application to reveal the mechanisms in occurrence, diagnosis and treatment of various diseases. Therefor, to study the mechanisms of 1α,25-dihydroxyvitamin D3 on osteoclasts' formation and activation, so as to learn about the mechanisms of bone remodeling under vitamin D. Osteoclasts will be induced from RAW264.7 by macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) in the study. The marker proteins of osteoclast, including RANK, TRAP, MMP-9, calcitonin receptor, tissue proteinase K, integrin αvβ3 and carbonic anhydrase II will be examined by western blot and their mRNA will be detected by quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (q-RT-PCR). In addition to this, the differential expression about osteoclasts' formation and activation related proteins from the control and 1α,25-dihydroxyvitamin D3 treated group, will be detected by two-dimensional electrophoresis and time of flight mass spectrometry.

尽管人们对维生素D调控骨代谢性疾病的机制进行了大量的研究，但其直接调控破骨细胞（osteoclast，OC）形成和活化的机制仍不十分清楚。而蛋白质组学对揭示疾病发生、诊断及治疗的机理具有重要的应用价值。本研究通过RANKL和M-CSF诱导RAW264.7细胞系形成OC，在此基础上添加不同浓度1α,25-(OH)2D3（0、10-9、10-8、10-7 mol/L以及溶剂对照）。分别采用western blot和q-RT-PCR法检测OC标志性蛋白（RANK、TRAP、MMP-9、降钙素受体、组织蛋白酶K、整合素αvβ3、碳酸酐酶Ⅱ）的表达水平及其mRNA表达量；重点以双向电泳与质谱蛋白质鉴定为手段，寻找1α,25-(OH)2D3调控OC形成和活化的关键蛋白点，并用western blot方法验证关键蛋白表达的变化，从而揭示维生素D调控OC形成和活化的机制，为骨代谢性疾病的防治提供理论依据。

尽管人们对维生素D调控骨代谢性疾病的机制进行了大量的研究，但其直接调控破骨细胞（osteoclast, OC）形成和活化的机制仍不十分清楚。而蛋白质组学对揭示疾病发生、诊断及治疗的机理具有重要的应用价值。本研究以RAW264.7细胞作为破骨细胞前体（osteoclast precursors，OPC），利用25 μg/L M-CSF与RANKL联合诱导生成OC。在此基础上，观察了不同浓度1α,25-(OH)2D3（10-7，10-8及10-9 mol/L）对OC形成和活性相关功能蛋白（整合素αvβ3、V-ATPase、CAⅡ、CTSK、TRAP、MMP-9）及关键转录因子（c-Fos、NFATc1）表达的影响。并利用双向电泳和质谱分析技术进一步分析了1α,25-(OH)2D3处理后蛋白表达的差异。结果表明，25 μg/L M-CSF与30 μg/L RANKL能够诱导RAW264.7细胞形成大量满足分子生物学研究的OC。不同浓度1α,25-(OH)2D3（10-7，10-8及10-9 mol/L）处理能够促进上述功能蛋白和关键转录因子的表达，增强OC的形成和骨吸收功能，其中10-8 mol/L作用效果最明显。1α,25-(OH)2D3作用1、3、5 d，双向电泳分析检测到23个差异表达的蛋白点，14个蛋白表达上调，9个蛋白表达下调，差异表达蛋白主要分布在第3 d，质谱分析和蛋白数据库检索证明这些差异蛋白分别参与多种生物学过程，包括细胞增殖、分化及凋亡相关蛋白（17%），细胞骨架相关蛋白（9%），参与应激反应及蛋白折叠修饰的蛋白（35%）以及与细胞代谢相关的蛋白（39%）。说明，1α,25-(OH)2D3能够上调OC功能蛋白和关键转录因子的表达，促进OC的形成和骨吸收功能。此过程涉及多种生物学过程，为生物信号转导机制的进一步研究提供了新的依据。