睾丸特异表达基因Fank1参与生精细胞凋亡的分子机制研究

Apoptosis and disorder of testicular spermatogenic cells are the important causes of male infertility. Apoptosis is involved in multiple genes in spermatogenic cells, in which the interactions among the various genes determine the fate of cells. Fank1 gene was found to be expressed specifically in testicular tissue through the gene screening, and widely expressed in the process of spermatogenesis from the haploid stage to the meiosis stage. At the same time it was proved that the gene was a specific transcription factor. When Fank1 genes expression decreased in testicular tissue, reduction of the number of sperm and increase of spermatogenic cells was shown in the phenotype. It suggests the gene may play an important role in spermatogenesis and apoptosis of spermatogenic cell. On this basis, in this study we use CRISPR/Cas9 technology to establish Fank1 gene knockout animal models and study its fuctions on testicular development, spermatogenesis and sperm cells apoptosis. We use gene chip to screen target genes of differencial expression and determine target genes of Fank1. And we use molecular biology methods, such as report gene promoter analysis, immune coprecipitation, EMSA and detection of the expression of target genes and its phosphorylation level, to further research the pathways and molecular mechanisms involved in apoptosis in spermatogenic cells. It may provide new clues and the possible targets for the diagnosis and treatment of male infertility patients

睾丸生精细胞凋亡发生紊乱是男性不育的一个重要原因，生精细胞凋亡是一个多基因参与的过程，各基因间的相互作用决定细胞的命运，Fank1基因是本课题组筛查到的睾丸组织特异表达新基因，在精子发生过程的减数分裂到单倍体阶段广泛表达，同时证明该基因是一个睾丸特异的转录因子，Fank1基因在睾丸组织中表达降低后出现精子数量减少，生精细胞凋亡增加的表型，提示该基因可能在精子发生以及生殖细胞凋亡中具有重要作用。本研究拟在此基础上，用CRISPR/Cas9技术建立Fank1基因敲除动物模型，研究其在睾丸发育、精子生成和生精细胞凋亡中的可能作用；通过基因芯片筛选差异基因，确定Fank1的靶基因，利用启动子报告基因分析、免疫共沉淀、EMSA及检测靶基因的表达和磷酸化水平等分子生物学方法，进一步研究Fank1基因在生精细胞中参与凋亡信号途径及分子机制，期望为男性不育患者的诊断和治疗提供新的思路和可能的靶点。

睾丸生精细胞凋亡发生紊乱是男性不育的一个重要原因，生精细胞凋亡是一个多基因参与的过程，各基因间的相互作用决定细胞的命运，Fank1基因是本课题组筛查到的睾丸组织特异表达基因，在精子发生过程的减数分裂到单倍体阶段广泛表达，同时证明该基因是一个睾丸特异的转录因子。在本项目中，通过采用CRISPR/Cas9技术建立Fank1基因敲除动物模型，我们发现Fank1基因缺失后，产仔周期及产仔数量、精子数量和睾丸重量与野生型小鼠比较均有显著性差异，但未导致不育。通过形态学观察发现Fank1基因敲除小鼠粗线期精母细胞到长形精子细胞阶段数量明显减少，生精细胞凋亡数量明显高于野生型小鼠。我们进一步应用Chip-Seq和RNA-Seq方法筛选凋亡相关差异表达基因，通过分析差异表达基因的启动子确认含有Fank1 DNA结合序列，并用Realtime-PCR 验证了8个启动子含有Fank1结合位点的差异基因；在此基础上，为了更好地研究Fank1基因调控生精细胞凋亡的机制，我们完成了Reporter system assay筛选Fank1可能诱导的转录因子以及构建Lrrc4c、Dusp1、Gm5458等调控报告基因重组载体，将其转染至293T细胞后，利用双萤光素酶报告分析，结果显示转录因子Fank1对Lrrc4c、Dusp1、Gm5458基因启动子均具有转录激活作用。同时利用生物信息学分析了Fank1启动子调控序列，有4个转录结合位点，应用荧光素酶报告基因分析法及染色质免疫沉淀实验（CHIP）证实HSF转录因子对Fank1基因启动子序列具有转录调控作用。另一方面，我们根据RNA-Seq筛选的基因，采用Realtime PCR 和 Western Blot检测靶基因在Fank1基因敲除小鼠生精细胞凋亡信号通路的表达水平。结果显示，与WT相比，Lrrc4c、Dusp1、Gm5458、c-Jun、Rab10os等基因表达水平明显下调，提示Fank1与多个靶基因结果，参与生精细胞凋亡的调控。上述研究结果充分验证了我们提出的假说，即Fank1基因通过HSF介导参与MAPK/JNK信号通路，影响c-Jun表达，同时还分别与下游靶基因Lrrc4c、Dusp1激活c-Jun的表达，共同作用于AP-1信号转导通路来抑制生精细胞凋亡，保证精子的正常发生。本研究对于男性不育患者的诊断和治疗提供新的思路和可能的靶点。