人EGFR显性负性突变体对胃癌作用及其分子机制的实验研究

作为基因治疗重要内容之一的显性负性策略，在近年来备受关注，其主要是指利用基因工程技术获得特定受体的显性负性突变体，使其高表达，通过高表达突变体的显性负性作用而对受体功能产生负性调控效应。本项目在前期工作中初步证实人表皮生长因子受体（EGFR）参与胃癌进展的基础上，拟构建人EGFR显性负性突变体（dnEGFR）的真核表达载体，转染胃癌细胞后表达dnEGFR，dnEGFR能够对内源性EGFR的功能产生负性调控效应。体外实验阶段探讨dnEGFR对胃癌细胞恶性生物学特征的影响，以及对放化疗的增敏作用，体内实验阶段探讨对裸鼠体内成瘤能力、转移、血管形成能力的影响，并检测相关分子指标，明确具体机制。本项目的开展，期望能为胃癌的基因治疗提供一条新的思路。

在分子生物学和基因工程技术飞跃发展的推动下，以免疫治疗为基础发展而来的肿瘤生物治疗日益受到重视，显示出良好的应用前景，成为肿瘤治疗的第四模式。在肿瘤生物治疗中，EGFR靶点扮演着重要角色，成为国内外研究的热点。作为肿瘤生物治疗方法内容之一的显性负性策略，在近年来备受关注，其主要是指利用基因工程技术获得特定受体的显性负性突变体，使其高表达，通过高表达突变体的显性负性作用而对受体功能产生负性调控作用。本项目通过检测胃癌手术切除标本EGFR的mRNA及蛋白水平，证实人表皮生长因子受体（EGFR）参与胃癌进展。构建人EGFR显性负性突变体（DNEGFR）的真核表达载体(pEGFPN1-DNEGFR)，转染胃癌细胞后表达DNEGFR，证实了DNEGFR能够对内源性EGFR的功能产生负性调控作用并明确了调控机制。在体外实验阶段，运用实时荧光定量PCR、逆转录PCR、ELISA、Western blotting检测、MTT检测、流式细胞术、TUNEL检测、软琼脂克隆形成实验、细胞粘附实验、划痕实验、Transwell侵袭小室模型、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）管腔结构形成实验等多种分子生物学技术，证实了DNEGFR能够抑制胃癌细胞增殖、克隆形成、运动、迁移、粘附、侵袭、促HUVEC管腔结构形成能力，部分逆转了胃癌细胞恶性生物学特征，并且明确了具体的分子机制。另外还证实DNEGFR对放疗及奥沙利铂化疗具有增敏作用，并且明确了具体分子机制。在体内实验阶段，项目组运用裸鼠皮下移植瘤模型及爪垫淋巴结转移模型证实DNEGFR抑制胃癌细胞的体内成瘤、转移、促血管形成能力，与体内实验结果相吻合。本项目的开展，为胃癌生物治疗提供一条新的思路，为靶向EGFR显性负性策略在胃癌生物治疗中进一步深入研究打下基础。