生长素合成相关基因YUCCA克隆及调控百合体细胞胚胎发生的分子机理研究

Lilium, a perennial bulbous plant belongs to Liliaceae, has highly ornamental, edible and medicinal value. The research group has established an efficient somatic embryogenesis regeneration protocol using roots as explants and PIC as exogenous hormone. We assumed that auxin biosynthesis and transport were essential for the somatic embryogenesis because adding auxin transport inhibitor (NPA) caused embryonic deformity. YUCCA genes are the key enzyme in the IAA biosynthetic pathway. Four different root lengths explants are selected to test endogenous auxin content during embryogenic callus induction period and mature embryos induction period by GC-MS, no apical roots as control. The study intends to use transcriptome technology to obtain the transcriptional profiling. Differentially expressed genes will be checked for functional annotation by bioinformatics analysis and the YUCCA gene will be found. Expression of YUCCA gene will be analyzed during embryogenic callus induction and mature embryos induction period by Real Time-PCR technology. Transgenic technology will be attempted to validate the YUCCA gene’s function in Arabidopsis. The study will provide a theoretical basis for revealing the mechanism of auxin-related YUCCA gene in somatic embryogenesis of Lilium spp..

百合为百合科多年生球根植物，具有极高的观赏、食用和药用价值。申请人所在的研究小组以百合根为外植体，在生长素类物质毒莠定（PIC）的诱导下建立了高效的体胚再生体系，加入生长素运输抑制剂1-萘氨甲酰苯甲酸（NPA）会导致胚胎发育畸形，初步推断外源生长素类物质的合成和运输影响着百合体胚发生。YUCCA基因是生长素主要合成途径中的关键酶，本研究拟选择百合含根尖的4种不同根长外植体，以不含根尖的外植体为对照，利用GC-MS技术分析测定胚性愈伤组织诱导和成熟胚诱导阶段内源生长素的含量变化；利用转录组学技术获得基因表达的转录谱，经生物信息学分析对差异基因进行功能注释，锚定生长素合成路径的主要基因YUCCA；利用Real Time-PCR分析YUCCA基因在百合体胚诱导及发育过程的表达情况，并利用转基因技术在模式植物拟南芥中验证该基因的功能，阐明生长素合成相关YUCCA基因在百合体胚诱导中的作用机理。

本项目以百合含根尖的根为外植体，在含有高浓度生长素类物质毒莠定（PIC）的MS培养基上诱导胚性愈伤组织，建立了最优胚性愈伤组织诱导技术体系和可以有效区分百合体细胞胚发生各个阶段的再生技术体系，在此基础上采用GC-MS技术检测胚性愈伤组织诱导与成熟胚诱导各个阶段内源生长素的含量；利用转录组测序技术分析获得了百合胚性愈伤组织不同诱导阶段的基因表达转录谱，经生物信息学分析对差异基因进行功能注释，在转录谱中获得6个生长素合成相关的YUCCA基因及其CDS全长，将百合YUCCA基因与拟南芥、玉米、水稻、葡萄进行亲缘关系比对分析，结果表明百合YUCCA基因与单子叶植物玉米、水稻的YUCCA基因亲缘关系较近。对8个候选内参基因在百合胚性愈伤组织诱导与体胚发育不同时期进行扩增并采用Genorm、Normfinder和Bestkeeper三种软件对候选基因的表达稳定性进行综合评价，发现百合胚性愈伤组织诱导与体胚发育的最适内参基因为bHLH。利用Real Time-PCR技术分析YUCCA基因在百合胚性愈伤组织诱导与体胚发育过程中的表达情况，发现YUCCA2、YUCCA4在胚性愈伤组织诱导阶段表达量上调，YUCCA6、YUCCA8、YUCCA9、YUCCA10在胚性愈伤组织诱导阶段表达量下调，YUCCA2、YUCCA4的变化趋势与内源生长素IAA的测定结果一致。YUCCA2、YUCCA6、YUCCA8、YUCCA9在体胚发育阶段表达量上调，而YUCCA4、YUCCA10在体胚发育阶段表达量下调，其变化趋势与内源IAA含量变化趋势一致。以百合根、鳞茎及愈伤组织为侵染外植体尝试建立根癌农杆菌介导的转基因体系获得阳性植株，初步建立了百合根癌农杆菌介导的转基因再生技术体系。