番茄类受体激酶WIN1调控系统素识别和信号转导的分子机制研究

Systemin is a peptide hormone produced by tomato in response to chewing insects and saprophytic pathogens. A wealth of evidence indicates that systemin and the oxylipin signal jasmonic acid (JA) regulate plant defense by a common signaling pathway. Toward exploring the molecular mechanism of systemin perception and signal transduction in tomato, we have constructed 12 mutants of receptor like kinase genes which are induced by mechanical damage or MeJA. win1, one of the receptor like kinase mutants, is defective in systemin response and expression of defense-induced genes. In vitro phosphorylation assays showed that WIN1 was an active kinase. Furthermore, we have identified multiple candidate interacting proteins WIPs by membrane yeast two-hybrid screening. In this application, we intend to explore the molecular mechanism of systemin perception and signal transduction by analyzing the function of WIN1 and WIPs. The main aims are: 1) to analyze if WIN1 can bind systemin directly and if the kinase activity of WIN1 can be activated by systemin treatment; 2) to explore the function of WIPs and the relationship between WIN1 and WIPs in regulating plant defense. This study will shed more light on our understanding of the systemin/jasmonate signaling pathway and the molecular mechanism underlying plant perception chewing insects and saprophytic pathogens.

系统素是番茄应对机械伤害和咀嚼式昆虫侵害时产生的一种由18个氨基酸组成的小肽激素。研究表明，系统素和茉莉酸通过共同的信号转导途径调控植物的防卫反应，但目前对系统素识别和早期信号转导分子机制所知甚少。我们以番茄为研究材料，鉴定了12个受系统素和茉莉酸诱导的类受体激酶基因，并用基因编辑的方法分别获得了其基因敲除突变体。其中一个突变体win1 (wounding insensitive 1)在主根生长抑制和抗性基因表达方面表现出对系统素不敏感的表型。体外磷酸化实验证明WIN1具有激酶活性。通过膜酵母双杂交系统筛选到多个与WIN1互作的候选蛋白WIPs。本申请拟进一步研究WIN1对系统素的结合活性和其激酶活性在系统素处理下的变化，解析WIN1与WIPs间的调控关系，阐明WIN1及WIPs在系统素识别和信号转导中的功能。为阐释系统素/茉莉酸信号途径以及植物对咀嚼式昆虫的识别机制提供创新性的知识积累。

系统素是番茄应对机械损伤和咀嚼式昆虫侵害时产生的一种由18个氨基酸组成的小肽激素。研究表明，系统素和茉莉酸通过共同的信号转导途径调控植物的防卫反应，但目前系统素信号感知和转导的分子机制鲜见报道。.我们以番茄为研究材料，鉴定了12个受系统素和茉莉酸诱导的类受体激酶基因，并用基因编辑的方法分别获得了其基因敲除突变体。其中一个突变体win1 (wounding insensitive 1) 在主根生长抑制和抗性基因表达方面表现出对系统素不敏感的表型。体外免疫共沉淀实验和LUC结合活性实验证明WIN1具有结合系统素的活性。体内及体外的磷酸化实验证明WIN1具有激酶活性。.通过膜酵母双杂交系统和IP-MS分析筛选到多个与WIN1互作的候选蛋白WIPs。通过体内体外的互作实验进一步验证了WIN1重要靶蛋白WIP1。进一步实验发现，系统素处理诱导WIN1对WIP1磷酸化，并使WIP1与WIN1在植物体内互作减弱。遗传分析表明WIP1在系统素信号途径中发挥正调控功能。通过质谱分析，鉴定到了WIP1上特异响应机械损伤和系统素的磷酸化位点，对该位点进行点突变后发现WIP1磷酸化的状态改变影响其定位和核酸结合功能。.通过RIP-seq、RNA-seq和ChIP-seq三种组学分析，证明WIP1可以结合RNA和DNA，具备多种核酸调控活性，并能响应系统素和机械损伤信号调控系统素/茉莉酸信号途径的多个效应因子的mRNA水平。.研究结果证明了WIN1是系统素受体，WIN1结合系统素，激活自身激酶活性，磷酸化底物WIP1，使WIP1从细胞膜上解离，进入细胞质和细胞核中分别调控基因表达和关键响应因子的mRNA稳定性，从而调控植物对系统素的响应，增强植物应对机械伤害和咀嚼式昆虫侵害的能力。研究结果为阐释系统素/茉莉酸信号途径以及植物对咀嚼式昆虫的识别机制提供创新性的知识积累。