miR-182通过MET和CTTN基因及其相关信号通路抑制肺癌转移的分子机理研究

Although metastasis is the overwhelming cause of death for lung cancer patients, its mechanism is still currently unknown. The role of miRNAs in invasion and metastasis has attracted increasing attention and is a promising research target. Based on our previous extensive research, we hypothesize that miR-182 inhibits lung cancer invasion and metastasis through inhibition of lung cancer epithelial-mesenchymal transition (EMT) and podosome movement by regulating the MET and CTTN genes. The present proposal will investigate the role of miR-182 in lung cancer invasion and metastasis using gene transfection and siRNA interference in vitro and in vivo. We will employ the luciferase assay to identify possible target genes of miR-182, such as MET and CTTN, and investigate the mechanisms by which miR-182 inhibits lung cancer cell EMT and podosome movement using immunofluorescence and transfection. We will use small molecular inhibitors and in vivo imaging in lung cancer animal models to investigate interactions between miR-182 and CTTN, MET, and related signaling pathways. Finally, we will investigate the expression of miR-182, CTTN, and MET in clinical specimens and analyze the relationships between the expression and clinical characteristics of the patients. This study will provide a theoretical, effective experimental basis for exploring the molecular mechanisms involved in lung cancer invasion and metastasis.

转移是肺癌患者死亡的最主要原因之一，但其机理尚不完全清楚。miRNAs在侵袭转移中的作用是目前研究的热点之一。课题组在大量前期工作的基础上提出miR-182可能通过MET和CTTN及其相关信号通路，调控肿瘤的EMT过程和细胞伪足运动，从而抑制肺癌转移的假设。本研究拟通过基因转染和siRNA干扰等技术在体内外探讨miR-182在肺癌侵袭转移中的作用；应用Luciferase assay等鉴定miR-182的靶基因MET和CTTN；通过免疫荧光等探讨miR-182通过MET和CTTN调控肺癌细胞的EMT和伪足运动的分子机制；应用不同抑制剂处理和活体成像技术，进一步在体内外探讨靶基因MET,CTTN及其相关信号通路与miR-182在肺癌转移过程中的交互作用和分子网络；并在大宗肺癌临床组织标本中对关键基因进行验证。为最终阐明肺癌侵袭转移的分子机制提供有效的理论基础和实验依据。

miR-182属于miR-183家族成员。目前研究表明，miR-182是一种肿瘤相关microRNA，在许多肿瘤组织中均发现miR-182的表达异常，并且在不同的肿瘤可能表现为致癌microRNA,也可能表现为抑癌microRNA。但是在肺癌中的作用还不明确。本研究应用qRT-PCR对58例肺癌患者肺癌组织，正常肺组织和肺癌细胞系的miR-182表达情况进行了检测。应用Kaplan-Meier(log-rank)方法对患者进行了生存分析。我们的研究表明，与原发性肿瘤组织相比，miR-182在转移性NSCLC细胞中表达下调。miR-182的过度表达能够显著抑制了肺癌细胞的迁移和侵袭，并且降低了肺癌细胞中的Snail表达水平，促进了上皮标志物（E-cadherin）的表达。进一步的研究表明，miR-182通过直接结合MET 3'非翻译区（3'-UTR）负调节MET基因的表达。此外，我们发现，miR-182抑制AKT的磷酸化和表皮间质转化（EMT）的转录因子Snail的核聚集。此外，miR-182可抑制肝细胞生长因子（HGF）诱导的肺癌细胞迁移，侵袭和EMT。在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中，miR-182可能通过MET / AKT / Snail的失活抑制EMT和转移，这提示miR-182可能作为NSCLC中新的治疗靶标。转移是癌症死亡的主要原因，并且是肺癌治疗的主要障碍。伪足(Invadopodia)是癌症特异性的前突结构，能够通过降解基质、穿透基底膜，在癌症转移中起着重要作用，但调控的确切机制尚未完全了解。在本项研究中提示cortactin(CTTN)在肺癌组织中上调，是非小细胞肺癌预后较差的标志。 佛波醇12,13-二丁酸盐(PDBU)和肝细胞生长因子(HGF)可诱导非小细胞肺癌CTTN表达和和侵袭性伪足的形成。miR-182通过靶向CTTN抑制非小细胞肺癌的转移和侵袭伪足形成。qRT-PCR结果显示，CTTN的表达与miR-182的表达呈负相关。miR-182 / CTTN通过抑制Cdc42 / N-WASP途径抑制肺癌细胞的侵袭性形成。此外，通过抑制CTTN，miR-182负调节侵袭性调控功能并抑制肺癌细胞中的细胞外基质降解。最后，我们的研究结果表明，miR-182靶向作用于CTTN，抑制肺癌伪足形成，从而抑制肺癌转移，这提示miR-182可能作为NSCLC