S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因关键序列确定与改造

S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosyl-methionine, SAM) 是广泛存在于生物体内的一种重要生理活性物质，现在临床上已应用于治疗抑郁症、肝病、关节炎等。SAM合成酶在动植物和微生物体内含量少、酶活不高，通常只能转化L-蛋氨酸为SAM，不能转化D-蛋氨酸。本项目通过基因洗牌技术（DNA shuffling）对微生物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶（EC2.5.1.6）进行技术改造，获取具有较强的(-)-SAM合成酶活，不但能利用L-甲硫氨酸合成SAM，而且还具有高效转化D-甲硫氨酸合成(-)-SAM能力的改良基因，通过改良基因和野生基因的序列比对，获得高效转化不同构型(D-, L-)甲硫氨酸为SAM的关键基因序列；构建表达高效SAM合成酶的基因工程菌，降低S-腺苷甲硫氨酸工业化生产成本，为微生物利用DL底物合成目标产物提供理论依据和合理路线。

本课题在原有研究基础上改善建立了腺苷蛋氨酸、甲硫氨酸、和合成酶的分析与目标产物的合成、分离提取制备方法；建立了菌种高密度结合流加发酵工艺，提高了发酵效率；在传统菌种选育、激光诱变育种基础上选育高产酵母Y19-49；结合在土壤中发现的可转化蛋氨酸菌株-杆菌，利用DNA shuffling技术对S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因进行定向进化改造，获得较强的SAM合成酶活；通过基因改良获得高效转化不同构型(D-, L-)甲硫氨酸为SAM的关键基因序列；在此基础上构建表达高效SAM合成酶的基因工程菌；目前已经获得高产腺苷蛋氨酸工程菌YL29-29，腺苷蛋氨酸产率2200mg/L,转化率21.5%；优化建立YL29-29发酵工艺、提取工艺，确定了以分子印迹聚合物、以环糊精准聚轮烷为“假载体”印迹识别蛋白质、大孔树脂为基础对生物转化后的菌体进行分离、浓缩，其工艺步骤为：细胞破碎→纳滤→减压蒸馏浓缩→粗提物→调节pH值→离子交换→洗脱，然后再进行一次减压蒸馏浓缩，得到腺苷蛋氨酸硫酸盐产物；菌体活化培养的条件为：时间25h，温度29ºC，搅拌转速100-300r/min；对该菌体加入DL-蛋氨酸或L-蛋氨酸后进行生物转化的转化条件为：时间70h，温度41ºC，搅拌转速450r/min。对生物转化后的菌体进行分离、浓缩、离子交换工艺所采用的离子交换树脂为强酸或弱酸性阳离子交换树脂，洗脱所采用的洗脱液为硫酸和对甲基苯磺酸。