家蝇Eiger/Wengen信号的免疫调控机制

The tumor necrosis factor/receptor (TNF/TNFR) system participates in diverse physiological and pathological events in vertebrates, such as cancer, inflammation and immune responses. Eiger and Wengen are found to be the sole counterparts of the TNF/TNFR superfamily members in Drosophila. Loss-of-function eiger mutants of Drosophila show lower immunity, but the underlying mechanism remains unknown. Base on the transcriptome and digital gene expression information, we identified a few members of the TNF pathway in Musca domestica. Preliminary test results imply these genes take part in the immune regulation of housefly. To understand the function of Eiger/Wengen pathway in immune system, the express profiles of Eiger, Wengen and TRAF will be investigated by Western blot, ISH, subcellular localization and Real-time PCR. The changes of AMP expression, melanization and phagocytosis will be detected following knowckout or knockdown of Eiger, Wengen and TRAF in housefly by RNAi and CRISPR/Cas9. Recombinant Eiger and cotransfection technology will be employed to analysis the affection of Eiger, Wengen and TRAF on the expression of AMPs in S2 cell. The main objective is to understand the regulation of Eiger/Wengen pathway on immune system and the relation between Eiger/Wengen pathway and Toll or Imd pathway.

在脊椎动物中，肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)系统参与多种生理病理过程，例如肿瘤、炎症和免疫等。Eiger/Wengen是最早从果蝇体内发现的唯一一对TNF/TNFR同源蛋白。Eiger突变会影响果蝇的免疫反应能力，但具体机制尚不清楚。本课题组通过转录组测序和基因数字表达谱分析，筛选到多个家蝇TNF通路成员基因，并已证实它们参与了家蝇免疫调控。本项目拟首先分析Eiger、Wengen和TRAF在家蝇体内的时空分布及亚细胞定位，以了解它们的表达模式。然后利用RNAi和CRISPR/Cas9技术对幼虫体内Eiger等基因进行敲低或敲除，观察抗菌肽表达、黑化反应和细胞吞噬作用的变化。利用重组Eiger和共转染技术在S2细胞内研究Eiger、Wengen和TRAF等对抗菌肽表达的影响，探讨Eiger/Wengen信号对免疫反应的调控模式以及与Toll和Imd通路间的联系。

在脊椎动物中，肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)系统参与多种生理病理过程，例如肿瘤、炎症和免疫等。Eiger/Wengen是最早从果蝇体内发现的唯一一对TNF/TNFR同源蛋白。本项目围绕家蝇Eiger、Wengen和TRAF6基因展开研究。利用Western blot、qRT-PCR等技术，检测发现Eiger、Wengen和TRAF6主要在幼虫的脂肪体和肠道中呈高水平表达；Eiger在3龄幼虫表达最高，Wengen随家蝇发育变化不显著，而TRAF6在成蝇中的表达明显高于幼虫；亚细胞定位发现Eiger、Wengen存在于细胞膜上，而TRAF6存在于细胞质中；3个基因均能应答于细菌刺激而发生上调；利用RNAi和qRT-PCR技术证实家蝇体内存在一条Eiger-Wengen-TRAF6-NFKb-AMPs信号通路，与Toll和Imd信号通路相互协调，共同调控抗菌肽表达和酚氧化酶活性，参与免疫应答；另外还发现家蝇受到重金属Cd2+、紫外线及氧化诱导物DOX刺激后，Eiger的表达显著上调，提示Eiger可能参与了机体的氧化应激反应；有趣的是，研究中意外发现敲低TRAF6表达会显著影响到家蝇的卵巢大小、产卵量及子代的存活率，在家蝇羽化后5天取其卵巢进行转录组测序分析，结果发现与对照组相比，TRAF6基因干扰组有1163个基因表达发生变化，其中变化最为显著的是与卵壳形成相关的绒毛膜蛋白、卵壳蛋白、过氧化物酶等基因，提示TRAF6可能参与调控绒毛膜蛋白基因的表达和卵壳的硬化过程，从而影响卵子发生；最后我们还制备了Eiger和TRAF6蛋白的单克隆抗体，为进一步研究Eiger在氧化应激中的功能和TRAF6在卵子发生中的作用打下了良好基础。总之我们按计划完成了全部研究内容，证实Eiger-Wengen-TRAF6信号通路参与机体免疫和氧化应激反应，同时发现TRAF6以一种Eiger非依赖的方式参与卵子的发生过程。课题研究取得了较为丰硕的研究成果，发表学术论文15篇，其中SCI收录11篇，培养研究生10名。