家蝇硫氰酸生成酶Rhodanese在免疫系统中的表达调控研究

Rhodanese is sulfurtransferase that can catalyze the transfer of sulfane sulfur from thiosulfate to cyanide with concomitant formation of thiocyanate. ROS play a signi?cant role in the innate immunity system of insects, these substances showed significant cytotoxicity against invading microorganisms. ESTs of Rhodanese gene were obtained by searching our transcriptomic database for Musca domestica, preliminary confirmed that involved in the antibacterial immune response. This project aims to the analysis of Rhodanese distribution in vivo and subcellular localization, in order to understand the expression pattern of Rhodanese.Then the construction of Rhodanese knockdown model, by detecting the activity of ROS, to study how the Rhodanese is related to the immune system, and then define its role in M.domestica immune system.

硫氰酸生成酶Rhodanese是一种重要的转硫酶，它可以通过转移硫代硫酸盐的硫原子到氰化物上，生成硫氰酸盐和亚硫酸盐，从而降低氰化物的毒性。自由基ROS在昆虫先天免疫系统中具有重要的生理功能，这些物质表现出极强的细胞毒性，可以直接杀死侵入的微生物。本课题组通过家蝇幼虫转录组测序，筛选到Rhodanese基因的ESTs序列，并初步证实它参与了家蝇抗菌免疫反应。本项目拟首先分析Rhodanese在家蝇体内的时空分布及亚细胞定位，以此了解Rhodanese的表达模式，然后构建家蝇Rhodanese敲低模型，通过检测免疫前后ROS的活性变化，最终明确Rhodanese是如何与免疫系统相关，进而阐明它在家蝇免疫系统中的作用。

项目计划书主要分为4个研究内容：（1）Rhodanese时空分布；（2）Rhodanese亚细胞定位；（3）获得具有体外活性的Rhodanese蛋白；（4）Rhodanese表达的调控机制。其中“Rhodanese亚细胞定位”细胞水平上的研究内容未能在昆虫细胞中完成。在开展细胞实验的过程中，前期主要对几种昆虫细胞（草地夜蛾SF9，果蝇S2以及蚊子ARG2）进行培养，通过进行反复尝试，由于细胞亚定位的实验技术手法不纯熟，未能在以上几种昆虫细胞中进行定位观察。为了研究Rhodanese基因在细胞中的分布情况，我们最后调整实验方案，构建了pEGFPN1融合表达蛋白，在Hela细胞中进行转染并观察融合绿色荧光蛋白分布的情况，完成了Rhodanese基因亚细胞定位的工作。.同时，按照预期我们成功克隆得到了家蝇Rhodanese基因的全长cDNA序列。通过实时荧光定量检测结果显示Rhodanese基因在2龄幼虫期表达量最高，并在肠组织中表达量最高。在分别感染革兰氏阴性和阳性细菌后，以及热激高温处理前后家蝇体内Rhodanese基因的mRNA水平均发生显著性变化。应对革兰氏阳性、革兰氏阴性菌的侵染，在免疫刺激12 h表达迅速上调，在42℃热激1 h后，Rhodanese的表达量明显上调。pEGFPN1-Rhodanese-GFP融合表达显示在Hela细胞主要分布于线粒体中。采用原核表达pET-30a系统，经纯化获得了体外具有活性的rRHOD和没有活性的rRHODC136A重组蛋白，检测了rRHOD的酶活并进行了酶活动力学分析。显微注射dsRNA敲低幼虫Rhodanese表达，测定SOD活性和MDA含量，与正常幼虫相比缺失Rhodanese（RHOD-）的幼虫体内SOD活性降低，脂质氧化的终产物丙二醛MDA含量升高。