转录因子Poap1在糙皮侧耳高温胁迫响应中的功能解析

Pleurotus ostreatus, commonly known as "Oyster mushroom", is a large edible fungus widely cultivated in China. Yield decline and quality deterioration caused by heat stress are major problems that must be faced in P. ostreatus large-scale cultivation. Our previous study showed the Poap1 transcription factor plays an important role in P. ostreatus heat stress response, but the regulation mechanism is not yet clear. Based on our previous studies, we will construct the overexpression and RNA interference vectors of Poap1 gene, and analyze the role of Poap1 gene in mycelial growth rate, microstructure, ROS content, lipid oxidation and protein oxidation. Use RNA-seq and CHIP-Seq technology to identify the downstream interactive genes, their pathways and their precise functional binding sites. Moreover, electrophoretic mobility shift assays (EMSA) and yeast one-hybrid assay will be used to verify the interaction between Poap1 gene and promoters of key downstream genes. Finally, the regulatory mechanism of Poap1 gene in P. ostreatus heat stress response will be revealed through these researches. Our studies have important theoretical and practical significance for clarifying the mechanism of heat stress response in P. ostreatus, reasonably guiding the production of P. ostreatus and reducing the loss of heat damage.

糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus），俗称“平菇”，是我国栽培最为广泛的食用菌。高温胁迫是导致糙皮侧耳产量下降和品质劣变的重要因素，也是糙皮侧耳规模化种植面临的一大问题。前期研究表明转录因子Poap1可能是糙皮侧耳高温胁迫响应中的关键调控基因，但其调控机制尚不明确。本研究将构建Poap1超表达和RNA干涉载体，分析Poap1基因在菌丝生长速率、微观结构、ROS含量、脂氧化和蛋白氧化等方面的作用；利用RNA-seq和CHIP-Seq技术挖掘和鉴定Poap1下游互作基因、所属途径及其准确的功能结合位点；利用凝胶迁移和酵母单杂交技术验证Poap1蛋白与下游关键基因启动子的相互作用，最终揭示Poap1基因对下游关键互作基因的调控机制。本课题的完成，对于明确糙皮侧耳高温胁迫响应机制以及合理指导糙皮侧耳的生产、减少热害损失具有重要的理论意义和实践意义。

糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus），俗称“平菇”，是我国栽培最为广泛的食用菌。高温胁迫是导致糙皮侧耳产量下降和品质劣变的重要因素，也是糙皮侧耳规模化种植面临的一大问题。前期研究表明转录因子Poap1可能是糙皮侧耳高温胁迫响应中的关键调控基因，但其调控机制尚不明确。本项目成功构建了糙皮侧耳poap1基因超表达载体和 RNAi 沉默载体，通过根癌农杆菌介导转化糙皮侧耳菌丝体，获得超表达菌株5株，干涉菌株3株。高温胁迫环境下的脂质过氧化实验结果显示poap1基因超表达有利于减少脂质过氧化发生及增加氧化酶的酶活；poap1基因干涉后脂质过氧化成都增强，氧化酶酶活变化不大。这表明poap1基因参与了糙皮侧耳高温胁迫条件下的生理反应。高温胁迫条件下poap1基因超表达菌株和野生型菌株的转录组测序结果发现：poap1基因超表达转化子上调基因101个，下调149个。与对照相比，poap1基因超表达调控的基因主要集中在氧化还原进程、酒精代谢过程、有机羟基化合物代谢过程等，而这些基因主要涉及甘油酯代谢、丙酮酸代谢等代谢通路。除此之外，我们还采用网络建模的方法，构建出poap1基因超表达调控的基因蛋白质相互作用网络，发现12个基因存在互作行为。其中cysteine peroxiredoxin、thioredoxin-like protein、cytochrome p450、delta2-dienoyl-isomerase在该网络中可能具有重要作用。试验结果表明，poap1基因可能通过对氧化还原过程的重要酶类进行调控，以抵御高温胁迫。在分析差异表达基因时，我们发现g7059基因，该基因在25和35℃的wt野生型以及25℃的超表达菌株中不表达，在35℃的超表达菌株中大量表达，与35℃的wt野生型相比，该基因上调倍数高达1276倍。进一步分析发现，该基因注释为gata-4 5 6 transcription factor，是一个锌指结构的转录因子。此后的酵母双杂交实验也证实该基因与poap1基因有互作，这表明poap1基因不仅直接调控相关酶类基因，还能作用于相关转录因子，依赖作用的转录因子发挥高温胁迫调控作用。本课题的完成，为合理指导糙皮侧耳生产、减少热害损失具有指导意义。