克东腐乳优势菌株关键蛋白酶靶向水解机制研究

本研究是对我国典型细菌发酵腐乳-克东腐乳的微生物动态变化及多样性进行分析，分离鉴定优势菌株，研究其产关键蛋白酶的靶向水解机制。利用PCR-DGGE技术分析不同发酵时期细菌16sRNA丰度变化规律，通过数据库检索，确定优势菌株种类；分离纯化优势菌株并鉴定；在利用SDS-PAGE分析优势菌株蛋白酶谱的基础上通过酶活力确定关键蛋白酶；利用SDS-PAGE与ESI-MS相结合的方法研究优势菌株关键蛋白酶靶向水解SPI产生的氨基酸和肽指纹图谱，揭示其在腐乳发酵过程中对腐乳风味产生的调控作用。本项研究利用分子生物学技术，从基因水平上揭示克东腐乳发酵过程中微生物动态变化规律；在分离纯化优势菌株基础上利用酶学技术研究其产关键蛋白酶的靶向水解机制。通过本项目研究为优良菌株选育及合理利用菌株资源奠定基础，同时为开发商业发酵剂和酶法生产腐乳提供理论依据。

利用分子生物学技术和经典微生物学技术揭示了克东腐乳在发酵过程中的微生态变化规律及其微生物多样性。PCR-DGGE方法检测出发酵过程中的27株菌，经典微生物学方法检测出发酵过程中的22株菌；在利用经典微生物方法分离纯化出优势菌株基础上，基于16sRNA序列的分子生物学鉴定结果与PCR-DGGE相同。利用微生物学技术研究了腐乳发酵过程中的环境因素对Staphylococcus carnosus、Kocuria rosea、Kocuria kristinae和Micrococcus luteus发酵特性的影响；利用蛋白质电泳技术对上述优势发酵剂菌株的蛋白酶谱系进行分析，通过测定蛋白酶活力确定优势发酵剂菌株的蛋白酶酶活，在此基础上利用酶学技术结合腐乳发酵的微环境因素研究了上述优势发酵剂菌株的酶学性质及环境因素对酶活的影响。利用氨基酸分析技术和液质联用技术阐明了优势微生物Staphylococcus carnosus、Kocuria rosea、Kocuria kristinae和Micrococcus luteus自身及其蛋白酶靶向水解SPI产生的氨基酸和肽指纹图谱，与传统发酵腐乳的氨基酸和肽指纹图谱做对照，与传统腐乳发酵的肽指纹图谱基本相同。上述研究结果揭示了上述优势菌株及其关键蛋白酶通过水解大豆蛋白产生的游离氨基酸和肽直接对腐乳发酵过程中的风味产生的影响与调控作用。本项目研究成果阐明了克东腐乳在发酵过程中的微生态变化规律，明晰了在发酵过程中的优势微生物种类和数量，揭示了优势微生物自身与其关键蛋白酶在腐乳这一传统发酵豆制品中对重要品质的贡献。通过本项目的实施，获得3项科研奖励，发表科研论文5篇，其中SCI检索论文2篇，获得国家授权发明专利1项，参编国家十二五规划教材《发酵食品工艺学》一部，培养硕士研究生5名。在本项目研究的基础上，本研究团队研制开发出腐乳用直投式发酵剂的生产关键技术，并获得了国家授权的发明专利。已经在克东腐乳有限公司实现了工业化应用。纯菌工业化生产技术的应用使腐乳的生产周期由传统发酵的5个月缩短到现在的3个月，在减少生物胺形成量的基础上保持了传统发酵食品的特征风味和感官特性。本项目的实施切实的推进了传统发酵食品的产业化升级，为企业带来了良好的经济效益和社会效益。同时也为其它传统发酵食品产业提供了可借鉴的发展模式。