嗜热链球菌氨基酸利用模式和氮浪费与压力胁迫的机制研究

The mechanism is not understood that amino acid application patterns and nitrogen wasting change with intracellular acid, rate of expelling acid and extracellular osmotic pressure during high cell density cultivation of Streptococcus thermophilus. Futhermore, this is closely related to media design for high cell density cultivation and obtaining high biomass yields. The relationship of intracellular acid, rate of expelling acid, extracellular osmotic pressure and amino acid consumption patterns, amino acid necessary patterns and nitrogen wasting will be revealed in the present work. On this basis, the major genes and proteins involved in regulating the pattern of amino acid metabolism will be clarified in amino acid metabolic pathway in Streptococcus thermophilus by transcriptional and proteomic techniques. The metabolic products of amino acids and nitrogen wasting will be analyzed with the final products of existing forms and places by metabonomics techniques. The mechanism on amino acid utilization patterns, nitrogen wasting and stress will be elucidated in the level of gene and molecular in Streptococcus thermophilus. The present research will rich the design theory of precision nitrogen source in high cell density cultivation of Streptococcus thermophilus. Furthermore, the present research will provide scientific theory for design of the optimal culture medium and obtaining high biomass by fermentation engineering and metabolic engineering technology.

嗜热链球菌在增殖过程中氨基酸利用模式和氮浪费随压力胁迫变化的机制尚不明确，此机制涉及高密度培养氮源的精准设计和高生物量的获取。为诠释此机制，本项目在阐明嗜热链球菌氨基酸消耗模式、需求模式和氮浪费与不断增加的胞内酸度、排酸速率及胞外渗透压间量化关系的基础上，利用转录组学技术和蛋白质组学技术揭示在嗜热链球菌氨基酸主要代谢路径中，哪些关键基因和蛋白参与了氨基酸代谢模式的调控与转换，以抵抗不断增强的压力胁迫而保持其生长和存活；利用代谢组学技术分析于上述调控模式下，嗜热链球菌消耗的氨基酸主要在哪些路径中被代谢、代谢流的分配以及氮浪费产物的存在形式和场所。通过组学数据的信息学整合从分子和基因水平诠释嗜热链球菌氨基酸利用模式和氮浪费随压力胁迫变化的机制。本项目的实施将进一步完善嗜热链球菌高密度培养氮源的精准设计理论；为通过发酵工程和代谢工程技术进行最优培养基的设计和高生物量的获取提供科学理论支撑。

为了高密度培养氮源的精准设计和高生物量的获取，本项目阐明了嗜热链球菌在增殖过程中氨基酸利用模式和氮浪费随压力胁迫变化的机制。嗜热链球菌为了适应不断降低的胞内pH和逐渐增加的乳酸钠浓度，对胞内的生理学状态作出了相应的调节。随生长率变化，氨基酸的有效利用率改变，当生长率为μ1时，氨基酸有效利用率最低；当生长率为μ2时，氨基酸有效利用率最高。在整个发酵过程中，氨基酸总消耗量是其总需求量的2.69倍。在菌体生长过程中氨基酸除满足菌体营养需求外存在一定的氮浪费现象，这与不断增加的胞内酸度、排酸速率和胞外渗透压之间相关。利用转录组学技术和蛋白质组学技术揭示了在嗜热链球菌氨基酸主要代谢路径中，为抵抗不断增强的压力胁迫而保持其生长和存活，参与氨基酸代谢调控的关键基因和蛋白。精氨酸脱羧酶-尿素酶代谢路径、氨基糖代谢路径、氨基酸间相互转化代谢路径、氨基酸与中心碳代谢路径、副产物代谢路径及应激蛋白与脂肪酸合成路径中关键基因和蛋白，在迟滞期末期、对数期末期及稳定期差异显著性表达，以应对此时胞内和胞外的环境压力，为维持细胞存活作出调整。代谢组学表明氨基酸主要在精氨酸脱羧酶-尿素酶代谢路径、氨基糖代谢路径、氨基酸间相互转化代谢路径、氨基酸与中心碳代谢路径中被代谢。在迟滞期末期、对数期末期及稳定期，菌体为了响应胞内和胞外环境压力，调节关键基因和蛋白，增加了功能性代谢产物的合成量。在发酵后期，在不断增加的环境压力下，大量中间代谢产物及潜在有毒代谢产物在胞内大量积累、不能及时排到胞外，这些代谢产物是造成氮浪费现象的主要原因。本项目的研究成果完善了嗜热链球菌高密度培养氮源的精准设计理论；为通过发酵工程和代谢工程技术进行最优培养基的设计和高生物量的获取提供科学理论支撑。